未来可期-CAR-T细胞疗法的发展及展望

图1：T细胞活化双信号

CAR-T细胞疗法治疗的原理是通过基因工程技术将识别肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen,TAA) 的抗体可变区基因序列与胞内信号区序列在体外进行重组(形成CAR),再通过病毒转染方式将编码CAR基因的重组质粒在体外转进已分离出的患者T淋巴细胞中，使T细胞表面表达能识别肿瘤抗原的受体蛋白，经体外大规模培养扩增后表达特异性嵌合抗原受体的T细胞称为CAR-T细胞[2]。由于治疗使用的Ｔ细胞来源于患者的外周血细胞，整个治疗过程没有免疫排斥反应。当大量CAR-T细胞回输到患者体内后，CAR能特异性地识别靶向肿瘤细胞的抗原，活化后的Ｔ细胞可以杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。

根据CAR的胞内结构域，对CAR的设计研究已经进行到了第五代[3]。初代CAR设计相对简单，由单链抗体通过跨膜区域与细胞内信号传导区免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM,Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)相连,ITAM通 常为CD3ζ或FcεRIγ,第一代CAR设计的信号域是单一的信号分子，而肿瘤细胞表面共刺激分子表达减弱或者缺失,因此CAR修饰的T细胞缺乏共刺激-第二信号的支持,T细胞激活后很快由于信号限制而丧失作用，这使得第一代CAR-T细胞在患者体内抗肿瘤效果有限[4]。作为改进,二代CAR在前一代的基础上引入了一个共刺激分子(如CD28，4-1BB，OX40等),用来激活第二信号，提供双重活化信号从而加强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性，这明显的改善了第一代CAR对T细胞激活不充分的缺点[5, 6]；三代CAR则在二代的基础上引入多个共刺激分子(如CD28、CD137、OX40等)，多种共刺激分子相互组合可以增强Ｔ细胞内的JNK、NK-kB等信号通路，使得T细胞表现出更强更持久的作用活性，这对增加T细胞的抗肿瘤活性、延长T细胞的增殖能力、生存周期及促进细胞因子(如IL-2、IFN-γ、TNF-α等)的分泌等方面均有显著的提升。但临床上第三代CAR研究较少，且三代CAR会造成T细胞刺激阈值降低，可能引起活化信号的泄露，从而诱发细胞因子释放过量，因此具体作用是否比二代CAR效果好还需要进一步研究[7]。四代CAR属于新型研究，相比三代CAR其整合了一个活化T细胞核因子转录相应元件，它可以使CAR-T细胞在肿瘤区域分泌特定的细胞因子(例如IL-12)，从而可以提高了T细胞在肿瘤微环境中的存活率，招募并活化其它免疫细胞进入肿瘤微环境中进行免疫应答[8]。五代CAR-T就是通用型CAR-T，它以基因编辑技术为基础，设计可以阻止人体发生排异反应的基因，并且可以进行异体Ｔ细胞的提前制备，随时提供给患者。但就临床应用来看，第二代CAR-T细胞疗法仍为主流。图2为CAR发展历程图。

2.CAR-T在实体瘤中的应用
相比于血液系统肿瘤，实体瘤中CAR-T的应用受到更多因素的限制，一方面，实体瘤发生部位不像血液系统散布全身，CAR-T细胞需抵达实体瘤病灶，并浸润到肿瘤内部，即使CAR-T细胞能够浸润到实体瘤内部，也会面临其内部免疫微环境的抑制，影响T细胞正常发挥作用；另一方面，实体瘤内部微环境存在偏酸、缺氧及营养缺乏等情况，也不利于CAR-T细胞发挥作用。此外，实体肿瘤缺乏较理想的特异性表面抗原，且具有不同的免疫抑制机制，因此CAR-T细胞免疫治疗在实体瘤的疗效不及血液肿瘤(特别是B细胞恶性肿瘤)，但其在神经母细胞瘤、非神经母细胞瘤、肉瘤、间皮瘤、胰腺癌等肿瘤中取得了较好的疗效。由June博士领导的小组在临床实验中，通过靶向间皮素(Mesothelin)的CAR mRNA瞬转入病人T细胞中，回输CAR-T细胞后，发现1例胰腺癌转移的晚期病人和1例晚期间皮瘤病人，均获得显著治疗效果，没有任何脱靶毒性发生[9]。HER2基因是受体酪氨酸蛋白激酶家族的成员，在很多肿瘤细胞过表达并且在上皮细胞上也有表达，在临床实验中，已经采用第二代CAR-T靶向HER2来治疗表达HER2的肿瘤患者[10]。另外，由于肿瘤新生血管与肿瘤的生长转移密切相关，应用靶向新生血管中过表达的血管内皮生长因子受体2(VEGFＲ-2)的CAR-T细胞进行肿瘤免疫治疗，能够抑制小鼠不同的肿瘤生长，且对正常组织无明显损伤，进而可以发挥间接抗肿瘤作用[11, 12]。

3.CAR-T 细胞疗法面临的挑战
CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗方面拥有很多优势，它可以利用非限制性的形式特异识别和杀伤表达特定抗原的癌细胞，以单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)作为抗原识别区段的CAR能够识别不同种类的抗原，包括糖类和脂类等非蛋白抗原，肿瘤表面的脂类抗原也可以作为靶点，而不再仅局限于蛋白类抗原。这扩大了肿瘤抗原靶点范围。此外，CAR-T细胞还可以分泌多种细胞因子实现其在体内的持续增殖，对肿瘤细胞有特异识别杀伤作用，同时，这些细胞因子还可以改变肿瘤免疫微环境对免疫细胞的抑制作用。尽管有着诸多优势，然而，新疗法不可避免的会产生一些新问题，特别是在治疗过程出现的严重毒副作用，其中以细胞因子释放综合征(CRS)最频繁、症状最突出。另外，脱靶效应、神经毒性以及插入突变都会影响CAR-T的最终疗效。

● 细胞因子释放综合征（CRS）
细胞因子释放综合征(Cytokine releasesyndrome，CRS)也称为细胞因子风暴，它是CAR-T临床应用中最显著的不良反应，严重的CRS出现概率为27%~53%，常发生于接受细胞治疗后6~20天[6, 13]。其发生机制是静脉输入CAR-T细胞后，在短时间内清除肿瘤细胞的同时会产生大量的炎症因子，如细胞因子、趋化因子，这些炎症因子会引起炎症反应导致组织损伤，甚至引起死亡。临床表现主要有发热、乏力、疲劳、心动过速、低血压、毛细血管渗透综合性以及心功能不全、弥漫性血管内凝血等症状[14]。目前关于细胞因子风暴造成的不良反应，解决方案主要有：使用糖皮质激素药物(如氢化可的松)来抑制细胞因子分泌；使用靶向阻断刺激细胞因子信号转导通路的药物（如IL-6受体抑制剂）[15]；引入可控性自杀基因(如caspase9或者HSV-TK)作为安全开关，在出现急性毒性时，可以快速诱导T细胞凋亡并逆转GVHD。另外，有研究构建一种默认为关闭状态，只有在调控药物作用下才会开启的“On Switch”CAR-T细胞，用以控制CAR-T作用的时间和剂量，提高治疗的安全性[16]。还有研究显示，CRS 与疾病进程或肿瘤负荷相关，在疾病负荷高的患者体内CRS更严重，因此在疾病恶化之前进行CAR-T回输治疗可降低CRS的风险[6]。

● 脱靶效应
脱靶效应是CAR-T疗法最主要的毒副作用之一。CAR-T细胞与肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)具有高度的亲和性，当正常组织与肿瘤细胞都表达同一种抗原时，CAR-T细胞无法区分，在攻击肿瘤细胞的同时会攻击正常细胞。如果靶抗原分子是严格的肿瘤特异性表面分子，就可避免脱靶效应的发生，但真正的肿瘤特异性分子到目前还非常少，因此，寻找仅表达于肿瘤细胞表面的靶抗原是CAR技术应用的首要任务。此外，通过设计多个抗原复合的CAR结构，识别抗原组合，提高杀伤的特异性也可降低脱靶效应的发生概率，比如同时靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治疗乳腺癌。肿瘤细胞的基因常常不稳定，一旦靶抗原丢失就会逃离CAR的识别，而间质细胞是肿瘤微环境的重要组分，直接影响肿瘤细胞，且基因表达相对稳定，故有研究选择基质细胞作为CAR杀伤对象，间接作用肿瘤细胞，以应对肿瘤细胞基因不稳定突变。

● 神经系统毒性
接受CAR-T治疗的B-ALL患者中29%~43%可发生神经系统不良反应[17]。CAＲ-T治疗白血病也可能引起神经系统症状。临床研究报道这种神经系统毒性表现多样，如谵妄、嗜睡、语言障碍、运动障碍、不同程度的脑病症状和癫痫发作[2, 18]。Maude等在接受CAR-T治疗的B-ALL患者脑脊液中发现了CAR-T，提示神经毒性可能与患者脑脊液中出现CAR-T细胞相关[2]。此外，JUNO公司进行的JCAＲ015Ⅱ期临床试验中， 在20余例患者中先后有3例出现因神经毒性作用导致的死亡事件；分析认为患者可能存在白血病细胞入侵中枢神经系统造成中枢神经系统白血病(Central nervous system leukemia，CNSL)，导致CAR-T细胞进入中枢神经系统杀伤肿瘤细胞，大量肿瘤细胞短时间内在脑组织中迅速裂解，从而形成脑部水肿; 因此在临床治疗中应排除CNSL患者。CAR-T治疗引起的神经毒性症状通常是自现性的，多数患者神经系统障碍可在短期内恢复，且没有后遗症。使用妥珠单抗或皮质类固醇激素无法明显缓解神经系统的症状，其背后的发生机制未明。

● 插入突变
CAR-T技术是在T细胞中插入一段外源的DNA片段，理论上说其结构已被破坏，存在一定的致瘤风险。虽然目前并没有关于基因改造T细胞致瘤性的报道，但研究者还是一直关注此问题的发生，也在不断通过优化载体的类型和转染的方式来降低插入突变的风险，某些研究中心已采用mRNA直接转导T细胞的方法来避免风险的发生[19]。此外，CAR-T疗法存在其它的不良反应，包括：过敏反应，移植物康宿主病(GVHD)，肿瘤溶解综合征等。

4.CAR-T细胞疗法未来发展趋势
一是治疗效果待提高。仅从短时间内的治疗效果看，CAR-T疗法对某些血液肿瘤的治疗效果十分显著，但若将观察期限进一步延长则发现，许多患者在经过CAR-T治疗几个月或更长时间后，会出现肿瘤复发的现象，影响患者预后。因此提高CAR-T细胞激活程度，提高其增殖能力，并延长CAR-T细胞在患者体内的存活时间是未来研究的重点方向之一。针对经CAR-T治疗后血液肿瘤可能再次复发的风险，我们可以设计同时靶向CD19与CD22分子的双特异性CAR-T，已有研究发现，在CAR-T治疗过程中，一些原本表达CD19的癌细胞可能转而表达CD22蛋白，因此CD19、CD22双管齐下，理论上能够增强CAR-T的效果。当前，改善CAR-T疗法在实体瘤中的治疗效果面临巨大的阻碍。
二是CAR-T的产业化。CAR-T疗法费用昂贵。目前，已获批的CAR-T产品和绝大多数CAR-T临床试验都是使用自体型CAR-T，即以患者自身的T细胞为起始材料，这种“私人订制”疗法的生产成本较高。诺华、Kite 获批的CAR-T 产品定价分别为47.5万美元、37.3万美元，高昂的价格限制了其市场潜力。诺华旗下的CAR-T产品在2018年第一季度取得了1200万美元的营收，只达到了预期的三成；Kite的CAR-T产品在获批后两个月内的销售额也不及预期。除费用高昂外，CAR-T疗法质量稳定性也比较差。患者自身的T细胞通常都存在质量与数量的缺陷，不同批次产品之间质量的稳定性较差，难以达到大规模的工业化生产及标准化的质量控制。
三是降低CAR-T细胞毒性。CAR-T疗法表现出的毒副作用说明，需要开发一些控制程序来调控CAR的活性。目前已经有大量方法用于控CAR-T的安全性，比如通过安装自杀开关对移植细胞进行快速清除，这种开关可通过小分子或者抗体来控制。常用的自杀开关包括可诱导的caspase-9(iCasp9)、单纯疱疹病毒中的胸苷激酶(HSV-TK)及自杀表位等。但自杀开关也会清除治疗性的CAR-T细胞，引发治疗反应的不可逆终止。因此，不清除CAR-T细胞的非细胞毒性的可逆系统对于控制毒性反应也许是有用的。
四是开发通用型CAR-T。目前全球主要有十几家公司从事通用型CAR-T开发。该技术主要依赖于基因编辑平台，使用CRISPR技术敲除T细胞中引起免疫排斥的基因，将其制成没有免疫排斥的、只特异性杀伤肿瘤细胞的标准化T细胞，使CAR-T转变为“off-the-shelf”的药品，与高成本“私人定制”的CAR-T不同，通用型CAR-T将会具备能规模化生产、剂量恒定、疗效优越等优点。目前，虽然大多数通用CAR-T的研发还处在临床前或临床早期阶段，但其极具吸引力的治疗潜力足以作为继续研发的强大推动力。通用型CAR-T的上市将会大大降低CAR-T疗法的成本，使这项技术惠及更多的病人。
CAR-T细胞疗法是一直免疫细胞治疗领域的焦点，极有希望彻底改变某些肿瘤(特别是血液肿瘤)的临床治疗现状，美国是全球最早开启CAR-T细胞治疗临床实验的国家，2010年以前，全球CA-T细胞治疗临床注册实验都集中在美国开展，我国从2012年起开始了CAR-T细胞治疗临床注册，每年新注册的CAR-T项目以数倍的速度爆发式增长，目前已成为全球CAR-T细胞疗法临床实验注册数量最多的国家，但是CAR-T细胞疗法在技术上和临床应用上仍然存在着许多亟待解决的问题。希望通过医药企业、临床医生、政府监管部门三方共同努力，建立高水准的标准化治疗流程以及制定一系列的法规政策，推动我国CAR-T细胞治疗技术临床应用的快速发展，为医学发展和人类健康做出贡献。

图3：CAR-T生产过程

5.CAR-T研究相关产品

1）CAR-T活化：CD3和CD28激发型抗体

2）CAR-T扩增：无动物成分重组细胞因子

3）CAR-T鉴定：预包被的ELISA试剂盒

 参考文献