KinExA分子和细胞相互作用仪与SPR的技术对比

一、背景：

Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美国创立，产品基于独特的Kinetic Exclusion Assay（KinExA^®）专利技术。在公司成立早期，Xavier大学、美国陆军和环境保护局等研究单位采用KinExA技术开展了大量工作；经过数十年在生物制药领域、科研领域及环境监测领域的广泛应用，KinExA技术已成为顶级制药公司和生物技术公司以及许多大学、独立研究实验室和环境监测机构研究相互作用和生物活性物质检测的必备工具，并且得到FDA和EMA认可。

二、KinExA的价值：

   新药研发成本动辄数十上百亿美元，灵敏可靠的仪器在研发早期即可协助准确甄选苗头候选药物（hit），减少不必要的支出，降低研发风险。由于KinExA可在生理条件下获取准确可靠的结合常数，具有很高生物相关性，而且成本极低，目前被很多顶级制药公司用作主要的验证工具。

三、KinExA  vs.  SPR：

1、与SPR的区别：SPR在芯片表面固定一个分子，通过芯片表明与溶液间二维相互作用的物质量改变而实现SPR检测。这就带来了非常显著的缺点：固定在芯片上的生物分子可能不能维持其天然活性、质量迁移影响动力学分析（例如，流速会影响实验结果）、被检测分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物结构其分子量有上限限制、样品需要纯化及无法检测完整细胞。

相反，KinExA分析三维水平及游离状态相互作用，不固定任何分子、不会对平衡带来影响、没有质量迁移的限制、可以检测未纯化样品和完整细胞；因此，极宽范围内的生物分子、生物结构及完整细胞均可灵活分析

2、与SPR技术的对比：为了表征治疗性单克隆抗体候选分子，研究者采用不同类型芯片，从Biacore系统获得同一组单抗-抗原的53组数据，与KinExA实验数据对比发现，亲和力及动力学数据与所使用的芯片类型有关，带负电荷的CM5,CM4及CM1芯片对Biacore的动力学数据有不利的影响。为了验证这一假设，作者通过Biacore液相实验，KinExA平衡态滴定以及KinExA动力学实验，精确计算抗体与抗原的亲和力及动力学参数。结果表明随着芯片表面负电荷的降低，亲和力及动力学参数与液相实验所得的结果越接近。可能的原因：（1）带负电荷的葡聚糖芯片与抗体之间的空间位阻影响抗原的结合；（2）带负电荷的抗原与芯片表面的负电荷静电排斥。

表中结果表明：对于Biacore技术，不同的固定方式（氨基偶联，捕获）以及不同的芯片，对实验结果均有明显影响。而采用KinExA技术，溶液中加葡聚糖，对结果也无明显影响。

图A,图B均采用KinExA技术检测。图A中buffer不含葡聚糖，K_D=24.7pM；图B中buffer加入葡聚糖，K_D=33.2pM。

图C，图D均采用Biacore技术检测。图C采用氨基偶联的方式CM5芯片固定抗体，K_D=2.05nM；图D采用捕获的方式CM5芯片固定抗体，K_D=2.86nM

四、案例

    案例一：完整细胞的相互作用检测

<背景>：单克隆抗体XMetA是胰岛素受体（IR）变构部分的激动剂，其激活代谢Akt激酶信号通路，而对有丝分裂胞外信号调节激酶（ERK）信号通路几乎没有影响。为了研究这种选择性信号通路的性质，作者验证了XMetA对CHO细胞中IR，Akt和ERK的特异性磷酸化和活化的影响。

<目的>：完整细胞亲和力检测。

<方法>：研究者将表达短链型（IR-A）及长链型（IR-B）胰岛素受体的不同浓度CHO细胞分别与XMetA孵育，通过离心获得游离的XMetA，用KinExA仪器检测亲和力。另外，作者采取同样的策略，用KinExA仪器检测胰岛素与CHO细胞表面IR-A，IR-B的亲和力。

<结论>：XMetA与IR-A亚型的亲和力为55±16pM，与IR-B亚型的亲和力为50±11pM。另外，在对照抗体组，胰岛素与IR-A亚型的亲和力为156±14pM；在XMetA组，胰岛素与IR-A亚型的亲和力为216±100pM；在对照抗体组，胰岛素与IR-B亚型的亲和力为221±28pM；在XMetA组，胰岛素与IR-B亚型的亲和力为277±112pM。数据同时说明， XMetA与IR亚型的结合与胰岛素无关。

     案例二：细胞与上清未纯化样品检测

<背景>：单克隆抗体（mAb）在体内与膜蛋白间亲和力的可靠评估是肿瘤治疗的主要问题。在BV展示系统中，膜蛋白能以天然状态在病毒表面展示。

<目的>：细胞与上清中未纯化样品亲和力检测。

<方法>：研究者基于KinExA技术，结合杆状病毒（BV）膜蛋白展示系统，描述了一个简单而高度敏感的单克隆抗体评估方法。

<结论>：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)与全细胞分析方法一致（R²=0.998），表明基于KinExA技术检测方法提供了针对细胞表面蛋白的单克隆抗体亲和力准确的评估。

上图中显示的是KinExA实验中所使用的抗原。A图中可溶性Robo1用于标准的实验分析；B图中表达天然活性Robo1的CHO细胞用4%多聚甲醛固定，用于细胞分析实验；C图中表达天然活性Robo1的BV磁珠用于BV展示分析

下图采用KinExA技术检测抗Robo1抗体与抗原的亲和力。曲线上方的数字代表抗体的活性浓度。

KinExA参考文献

  Danial M, et al. 2017.Site-Specific Polymer Attachment to HR2 Peptide Fusion Inhibitors against HIV-1 Decreases Binding Association Rates and Dissociation Rates Rather Than Binding Affinity. Bioconjug Chem. 10.1021/acs.bioconjchem.6b00540.

  Fleming JK, Wojciak JM. 2017. Measuring Sphingosine-1-Phosphate: Protein Interactions with the Kinetic Exclusion Assay. Methods Mol Biol. 10.1007/7651_2017_5.

  Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

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