Annexin V凋亡检测常见问题分析

常见问题分析：

实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。
 • 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
 • 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA 的消化会影响染色，建议使用无EDTA 的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。
 • 细胞离心用冷PBS 洗涤后，应尽量吸干残余液体，残余过多的PBS 中含有磷酸根，会形成磷酸钙沉淀，影响Annexin V的染色。
 • Annexin V结合液瓶盖要盖紧密封，长时间暴露于空气后，空气中的CO2 进入后形成CaCO3 会产生沉淀，从而减少游离的Ca2+，导致实验的结果不佳。
 • 污染其他的缓冲液。如吸取PBS后不更换Tip 头会导致游离的Ca2+的减少，从而导致实验的结果不佳。
 • 阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并检测，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。

实验过程中阳性率偏高。
 • 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3 次以后才能进行实验。
 • 细胞操作不当。贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏，使得假阳性偏高。
 • 凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48 小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。