呼吸道合胞病毒感染对豚鼠咳嗽相关气道功能及其神经递质的影响

呼吸道合胞病毒(RSV)是人类上呼吸道感染(URI)最重要的感染病原之一，尤其是儿童。RSV大约引起儿童90％的支气管炎，几乎所有婴幼儿在生后头3年都感染过RSV[1]。因此，进行RSV感染引起咳嗽的研究具有重要意义。目前认为，咳嗽反射敏感性(CRS)异常增高是机体咳嗽反应的一个十分重要的原因。O’Connell等L21的临床研究发现，URI引起的咳嗽患者CRS升高是其主要特征，并不伴气道反应性(AR)增高。但是，迄今为止，有关感染后咳嗽的真正机制知之甚少，还未见到RSV感染引起咳嗽的动物研究，病毒感染往往伴发AR升高，那么AR是否在感染后咳嗽中起关键作用呢?

    辣椒素受体亚型1(vanilloid receptor-1，VRl)是瞬时受体电位通道蛋白的超家族的成员之一。有研究发现慢性咳嗽患者VRl显著高于健康者；而且，CRS与支气管黏膜的VRl表达呈高度相关；气道平滑肌VRl的表达也增强。表明VRl参与了慢性咳嗽的发病过程[3]，但病毒感染后VRl如何改变目前还缺乏研究。有研究发现，RSV感染可以引起标记呼吸道总神经纤维分布的蛋白基因产物9．5(protein gene product一9．5，PGP一9．5)的分布及表达

水平改变[4]。本研究将通过动态观察与咳嗽有关的CRS、AR、VRl和PGP一9．5蛋白的变化，探讨RSV引起咳嗽，尤其是感染后咳嗽的发病机制。

1材料与方法

1．1

主要实验仪器和试剂    胎牛血清及MEM、DMEM／F12培养基购自美国Gibco公司，辣椒素购自美国Sigma公司，VRl鼠抗单克隆抗体均购自英国Abcam公司。HRP标记免疫组化二抗购自美国Invitrogen公司。单腔非限制型小动物体描仪购自美国Buxco公司，Leica DM4000智能型生物显微镜购自德国Leica公司。

1．2细胞培养和RSV的培养、收获及定量    人喉癌上皮细胞株(Hep一2)和RSV病毒株均来源于美国ATCC，Hep一2细胞是对RSV敏感的细胞，用于病毒株的传代培养。当Hep一2细胞在培养瓶中长至70％～80％融合后，取病毒悬液接种于细胞上，每15分钟摇动1次，吸附2 h后倒出病毒液，加入2％胎牛血清的培养基，于第2～3天开始出现细胞病变，待病变达50％～60％时收获病毒，将细胞反复冻融2～3次后lO000 r／min，4℃，离心20 min，去除细胞碎片，收集上清分装后液氮中冻存。空斑技术测定病毒感染滴度，以空斑形成单位(pfu)来表示病毒感染滴度。

1．3动物分组、饲养、病毒接种和哮喘模型制作    雄性纯白SPF级豚鼠来自广东省实验动物中心，体质量250～300 g。随机分成5组，即正常对照组和4个病毒感染组。病毒感染组按病毒感染后天数又分为感染后6、12、28和42 d四个组。每组10只。SPF级环境下饲养，感染组动物单独饲养，在适应新的环境1周左右后开始接种病毒。病毒滴鼻：乙醚麻醉后，两侧鼻孔分别滴入75“l的事先扩增冻存好的病毒液，病毒滴度为3．72×105 pfu。哮喘模型制作：腹腔内注射含5％鸡卵自蛋白和10 g／L氢氧化铝混合液1 m1致敏，15 d后予卵白蛋白吸人诱发哮喘发作。

1．4豚鼠CRS的测定通过辣椒素咳嗽激发试验判断气道的CRS。其原理是通过雾化吸入特异性的刺激物，激活气道感觉神经末梢的咳嗽感受器，诱发咳嗽的产生，以激发物的浓度和咳嗽程度判断CRS。辣椒素是红辣椒的刺激成分提取物，因为其安全、剂量依赖性和可重复性好，所以很适合用作CRS的评价。用单腔非限制型小动物体描仪测定豚鼠的CRS，各组动物分别在预定时间进行辣椒素咳嗽激发试验，判断CRS的指标主要是咳嗽总次数(CCnt)，方法参照Lewis等口1的研究所描述的。辣椒素激发溶液浓度为50弘mol／L，总量为1 ml，观测记录10 min(含雾化时间)内的CCnt。

1．5

豚鼠气道高反应性(AHR)的测定     CRS测定后12 h，用Buxco无创肺功能仪检测豚鼠的增强呼气间歇(enhanced pause，Penh)。测定100弘l倍增浓度的乙酰甲胆碱(MeCh)雾化激发后Penh的变化，激发浓度由低到高，依次为100、200、400、800、1 600 mg／L，记录各浓度级MeCh激发下的Penh平均值。将每个MeCh激发浓度下的Penh值转换为与生理盐水激发时Penh值的百分比，以Penh％表示，作为AHR的评价指标。

1．6

Real—time PCR方法检测肺组织VRl的mRNA相对表达    Primer5．o设计的RSV引物序

列如下：VRl正义引物：5’一TCAAAGACCC—GGAAACAGGG一3’，反义引物：5’一CTCTACCA—GGAGGGTCACCA一3’，产物224 bp；GAPDH(内参照)正义引物：57一TGGTGCCAAAAGGGTCA一3’，反义引物：5’一CCTCCACAATGCCGAAGT一3’，产

物176 bp。提取组织总RNA。采用2一心、相对定量法来计算VRl mRNA的表达水平。

1．7免疫组织化学方法检测豚鼠肺组织VRl和PGP．9．5蛋白的表达及免疫组化结果图象分析(半定量方法)

DAB染色免疫组化图片用Leica显微镜观察、拍照，进行蛋白表达强度(灰度)的比较。根据以下染色深浅行半定量分析：0=无染色；1一轻度着色；2一中度着色；3一强着色；4一很强着色(几乎呈黑色)。每张片子至少随机分析5个高倍视野。所有片子均由2个不知情的人分析。

1．8统计学处理    采用SPSS 16．o统计软件进行分析，数据以z±s表示。因样本数不多，标准差偏大，各组间总体检验采用非参数经验Kruskal—Wallis法，组间比较采用Bonferroni的组问比较检验法。P<o．05为差异有统计学意义。

2

结果

2．1

豚鼠CRS测定结果感染后6、12、28和42 d组豚鼠CRS分别为：(8．oo±3．86)、(8．70±6．20)、(7．60±4．40)和(6．70土3．71)CCnt，均较正常对照组[(2．50±1．43)CCnt]升高(P<o．05)，以感染后12 d组升高最为明显(P<0．01)；而哮喘组CRS为(3．90土1．60)CCnt，与正常对照组比较差异无统计学意义。

2．2豚鼠AR的改变

图1结果显示，急性感染后12 d组豚鼠AR对2个高浓度MeCh刺激结果是(1 069土156)％和(1 846±285)％，均高于正常对照组(P值分别<0．05和o．01)。虽然其他感染组部分豚鼠AR也有一些不同程度的增高，尤其是第28天组，但由于个体差异大，整体与正常对照组相比差异无统计学意义。而哮喘组豚鼠与正常对照组相比均有明显AHR。

注：哮喘组与正常对照组比较。aP<0．05，6P<0．01；感染后12 d组与正常对照组比较，cP<0．05。6P<0．01

图l

呼吸道合胞病毒实验豚鼠气道高反应性的改变(H一8)

2．3

Real—time PCR方法检测肺组织VRl mRNA相对表达结果表1显示RSV感染后6、12和28 d组VRlmRNA表达分别为：1．57士O．43、1．61±0．47和1．68±o．56，均高于正常对照组(P值均<O．05)，而以感染后28 d组为最高。

2．4

VRl和PGP一9．5蛋白的免疫组织化学结果见图2及表2(单位以灰度表示)。与正常对照组相比，病毒感染组豚鼠肺组织可见深黄色阳性反应物。表达强的阳性反应颗粒颜色较深，阳性反应细胞数量也显著多于正常对照组。感染后28 d组VRl表达为2．14(1．00)，较正

注：VRl：辣椒素受体亚型1；A：完全正常的免疫组化结果；B：VRl强表达；C：PGP-9．5强表达

图2    VRl和PGP一9．5蛋白的免疫组化结果DAB染色×400

常对照组[1．14(o．oo)]增强(P<0．05)。感染后12 d组PGP一9．5表达为2．29(1．00)，较正常对照组增强(P<O．05)。

3讨论

    众所周知，病毒感染引起的咳嗽是急性咳嗽的最常见原因，而病毒感染后咳嗽一般为亚急性咳嗽，时间为3～8周，在亚急性咳嗽中占绝大多数，因此本实验选择了感染后6、12、28和42 d作为观察时间点。本研究发现所有感染组豚鼠的CRS均较对照组明显升高，亚急性阶段甚至还高于急性咳嗽阶段。因此，本研究的特点类似0’Connell等比研究中的临床呼吸道感染咳嗽患者，说明CRS的升高可能是病毒感染引起咳嗽的主要特点。病毒感染导致了机体的咳嗽反应增加的机制涉及到病毒引起的气道炎症，改变了控制气道的传入和传出神经，最终引起持续的咳嗽；或者是因为炎症介质引起咳嗽有关的感受器致敏。

    哮喘也是咳嗽的一个常见原因，咳嗽可以作为典型哮喘的前身或作为其单独的主要症状，即我们所熟悉的咳嗽变异性哮喘(CVA)。CVA同感染后咳嗽很相似，但是它们存在2种完全不同的机制，CVA是由于气道平滑肌的痉挛引起，对支气管扩张剂敏感，而CRS正常L”⋯。而后者正如O7Connell等心1的研究发现的，则是因为CRS的升高。因为多数这些临床患者可以提供URI的病史，说明有可能是他们的咳嗽感受器在URI后变得持续敏感。因此，URI可能是通过引起辣椒素敏感的气道传入神经的敏感性增加而引起感染后咳嗽，伴或不伴气道直径或反应性的变化。

    目前认为病毒感染因为破坏了气道上皮，与咳嗽密切相关的C神经纤维末梢裸露；然后刺激物引起神经末梢释放各种神经肽，不仅直接使CRS增加，并且通过活化胆碱能神经纤维释放乙酰胆碱。RSV感染引起的气道病理生理改变及相关的临床症状除了与病毒复制直接损伤相关外，更主要的是由于感染诱发了大量的细胞凶子和炎症介质释放而引起的气道免疫炎症损伤和异常修复过程。同时，病毒感染通常可以通过引起多种气道炎症因子的释放等机制，引起AR的升高。本研究中发现RSV感染导致了豚鼠CRS持续增加，同时也引起了感染组AR均有不同程度的提高。但总的说来，AR的升高与CRS的升高不平行，亚急性咳嗽阶段AR升高不明显，而后者甚至更高；哮喘组豚鼠虽然有气道痉挛，每个MeCh浓度均有明显AHR，但对辣椒素刺激的CRS并不随之增加。因此，在感染急性期的急性咳嗽中可能有气道痉挛参与，但在感染后咳嗽阶段可能关系不大，也可以说，在感染后咳嗽中AR的增高是伴发的，在其发病机制中并不起决定作用，如果给予支气管扩张剂为主的治疗可能没有太大意义。Pounsford等u叫报道支气管扩张剂能明显缓解支气管痉挛引起的哮喘患者的咳嗽反应，但对正常人的咳嗽反应没有影响；而Fujimura等凹]证明美喘清对CRS没有影响，而且吸入乙酰胆碱引起支气管痉挛但也不能增加CRS。哮喘患者吸入盐水、变应原前后的CRS差异无显著性，咳嗽阈值和气道嗜酸粒细胞性炎症、AHR均没有关联L8]。如支原体肺炎一样，尽管咳嗽症状明显，但CRS均没有明显增高‘引。

    气道炎症引起的组织充血、水肿及细胞变性、坏死等改变可在局部形成一个含质子的低pH和中热的环境，使咳嗽受体的兴奋性增加，合成更多的VRl。多种炎性介质也能直接致敏VRl受体，形成恶性循环，因此病毒感染引起的气道炎症可通过VRl等神经递质的变化，最终使咳嗽感受器发生功能性改变。本文VRl基冈表达的动态结果显示，其mRNA水平在感染后均明显上调，在28 d组达到高峰；而在28 d组VRl的蛋白表达也明显增强，正是引起感染后亚急性咳嗽的时间。因此说明了VRl可能与RSV感染引起感染后咳嗽的发病机制

有关。有研究发现，RSV的持续感染诱发了P物质和PGP的增加，改变了气道的神经分布类型，甚至引起了重塑性变化，因此与气道功能的持续改变有关|。本研究中发现RSV感染后，代表呼吸道总神经纤维，也包括支配神经肽SP亚群的神经纤维分布的PGP一9．5，在感染后12 d组的表达明显增强；其他时间组的表达虽有所增强，但无统计学意义，因此需要更多的重复实验。但目前结果至少表明RsV感染后可能存在气道神经纤维分布和构成的改变，其结果可能导致与咳嗽相关的神经功能的改变，因此提示了一些研究所提到但没有证明的病毒感染性咳嗽的关键机制，将可能对未来的治疗产生一定的指导意义。

    总之，豚鼠RSV感染后出现了CRS的明显增加，与URI咳嗽患者的临床特征一致，并伴随感染后急性期第2周的AR明显增高。感染后VRl的mRNA水平出现明显上调，28 d组的蛋白表达也明显增强。感染后12 d组PGP一9．5的蛋白表达明显增强。表明RsV感染后引起的气道功能及相关神经递质的变化可能与病毒感染性咳嗽，尤其是感染

后咳嗽的发病机制有关。