用于PCR的植物基因组DNA快速制备方法

王兰^{1, 2}   龙云铭²  刘耀光²
1 华南农业大学农学院，广东省植物分子育种重点实验室
2 华南农业大学生命科学学院，广东省教育厅植物功能基因组与生物技术重点实验室

摘要：本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法。该方法只需将少量(4～6mg)植物叶片、适量(200μl) TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管，在组织细胞研磨器中振动5min破碎组织后，直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点，特别适合于大量样品的基因型检测。

关键词: 水稻，DNA制备，PCR

随着生物技术的迅速发展，PCR技术已广泛应用于遗传育种的各个领域，如种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。在大规模的基于PCR的基因型检测作业中，高效快速的模板DNA制备显得非常重要。自Marmur 1961年建立用十二烷基磺酸钠(SDS)和氯仿从生物细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来,人们一直致力于对DNA抽提方法的探讨，并先后报道了一些关于DNA抽提的方法（Dellaporta et al., 1983; 宣朴等，1998；汪秀峰等，2002；周淑芬等，2004）。但这些方法仍然烦琐费时。本研究对作为PCR模板的植物基因组DNA制备方法作了简化,只需将少量叶片、适量TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管，在组织细胞研磨器中振荡约5min破碎组织后，直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点，特别适合于大规模的基因型检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料
试验材料为粳稻品种台中65（T65）及其杂种不育基因Sc的近等基因系E5，以及它们杂交组合构建的F2群体，以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia。

1.2 基因组DNA制备方法
剪取（或用手摘取）水稻苗或成株叶片（剪成约3～5mm小段）或拟南芥叶片约4～6mg，12～15mg，或25～30mg，放入2ml离心管中（注：2ml离心管的底部较宽，利于钨合金珠的振荡），加入200μl TE （10mmol/L Tris, pH8.0; 0.5mmol/L EDTA, pH8.0. 注：本TE中的EDTA浓度是常规TE的1/2）或200μl去离子水，放入一粒3mm直径的钨合金珠（Qiagen, Cat.69997），在多功能组织细胞研磨器（方统生物科技有限公司，型号MTM-60）上振动约5min，把叶片打碎。取17μl溶液以琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA质量，取1μl溶液用于PCR扩增。

1.3 PCR引物反应
根据公共数据库的水稻和拟南芥基因组序列设计PCR引物（表1），由英俊公司合成。Taq酶从杰顺公司购买。

表1  PCR引物序列

每个PCR反应液（20μl）组成为：1× Buffer，0.2mmole/L dNTPs, 1U Taq酶,250nmole/L每种引物，1μl上述DNA溶液。PCR反应在My Cycler (BioRad)热循环仪上进行。用引物反应程序为94℃预变性3min，扩增35个循环，每个循环94℃ 20s， 55~58℃ 30s，72℃ 60s (InDel标记的PCR用30s)；最后72℃ 2min。

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及检测　

1.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
配制6%的聚丙烯酰胺凝胶100ml工作液:分别加5.7 g丙烯酰胺 (Acri)，0.3g N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis-Acri），12g尿素，10ml 10×TBE，最后加水至100ml。灌胶前，每10ml胶液加入80μl 10%过硫酸铵，4μl四甲基乙二胺(TEMED),摇匀后迅速灌胶，胶凝固后即可点样电泳，并通过银染检测实验结果。

1.4.2 银染　
先用0.1% AgNO3染色液染色10～15min，再用显影液（100mL中含NaOH 0.5g、四硼酸钠0.019g, 0.4mL甲醛）显色,等条带清晰后，直接用自来水冲洗终止显色反应，用凝胶成像仪（BioRad）或数码相机拍照并记录实验结果。

2 结果与讨论

2.1 PCR模板DNA的快速制备
本方法是将少量植物叶片在TE溶液或去离子水中，经钨合金珠在离心管内的振荡破碎，直接获得DNA溶液。用多功能组织细胞研磨器（MTM-60）一次可操作60个样品。琼脂糖凝胶电泳表明，用TE和去离子水都可获得分子量较大的DNA片段（图1A）。用TE制备的DNA在4℃下可保存10天以上，在冷冻下可保存半年。而用去离子水制备的DNA容易降解，保存时间较短，因此我们采用TE为主。

图1 本方法制备的水稻和拟南芥基因组DNA。

注：A: 用TE（泳道1～5）和去离子水（泳道6～10）制备的水稻基因组DNA (4～6mg叶片/200μl)。 M为分子量标记。B, C: 用200μl TE制备的不同浓度的水稻（B）和拟南芥（C）基因组DNA。泳道1～3为4～6mg叶片；4～6为12～15mg叶片；7～9为约25～30mg叶片。

2.2 不同量的模板DNA的PCR扩增效果
本方法制备的基因组DNA没有经过纯化，含有各种可能抑制Taq酶活性的杂质。因此，加入过多的粗制DNA可能会影响PCR反应。为了找出适合于PCR反应的DNA量，我们在一定量的TE（200μl）中加入不同量（4～6mg、12～15mg和25～30mg）的水稻和拟南芥叶片制备基因组DNA（图1，B, C）。选用2对水稻的引物（PR1、PR2，扩增产物长度分别为540bp和890bp）和1对拟南芥引物（PA, 扩增产物长度为1 kb），取1μl DNA在20μl的体系进行PCR反应。结果表明，对扩增较小的DNA片段，所有模板都能扩增出产物，但用4～6mg叶片制备的模板DNA获得最好的扩增效果（图2A）。对扩增较大的DNA片段，只有用4～6mg叶片制备的模板DNA获得较稳定的扩增效果（图2B, C）。

图2 不同量的基因组DNA为模板的PCR反应的琼脂糖凝胶（1％）检测

注：A，B，C分别为用引物PR1，PR2，和PA进行PCR。在所有反应（20μl）含有1U Taq酶和1μl基因组DNA；泳道1～3，4～6，7～9分别为以4～6mg，12～15mg，和25～30mg叶片在200μl TE中制备的基因组DNA。

本实验说明，用4～6mg（可以多至约10mg）叶片/200μl TE的比例制备基因组DNA溶液所含的杂质浓度较低，加入1μlDNA溶液到20μl反应体系中不会抑制Taq酶的活性。而加入1μl较高浓度的模板DNA对PCR反应的抑制作用较大。由于模板DNA量较少（约1～2ng/μl），PCR循环数比用较大量的纯化DNA模板（一般用20~50ng）的PCR要多些（多3～5个循环）。虽然可以将用较多叶片制备的模板DNA稀释使用或加入较少量（<1μl）的模板DNA也能获得好的PCR效果，但从简化操作步骤，提高工作效率考虑，确定最佳的经验值对效率化的大规模样品检测尤为重要。由于加入的样品叶片量有一个合适的范围，在实际操作中，并不需要所有样品都用天平称取，以经验目测估算即可。

2.3用于分子标记的基因型分析
由于用本方法制备的基因组DNA可以PCR扩增出较大的目的片段，对于PCR分子标记，如微卫星（SSR）、插入/缺失（InDel）、单核苷酸多态（SNP）等检测较短的DNA片段（一般<200bp）应该是可行的。我们用4对位于水稻籼粳杂种花粉不育基因Sc（Yang et al., 2008）连锁区的InDel标记引物（表1）对F2群体进行的基因型分析。图3显示了部分结果，所有标记的PCR扩增效果稳定，聚丙烯酰胺凝胶电泳的DNA条带均清晰易辨。

图3  用InDel分子标记的水稻基因型检测

注：A～D分别为用引物L14-121，J04-91，P24-83，和P24-93的PCR。左边起第1和第2泳道分别为亲本E5和T65、其它泳道均为F2个体。