褪黑素通过改善钙处理异常减轻睡眠剥夺时对房颤易感性的影响研究

研究背景：

心房颤动（atrial fibrillation，AF）是常见的心律失常，与心脏和心外危险因素密切相关，其中与睡眠紊乱密切相关。睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）在现代社会普遍存在，严重影响公众健康，研究表明睡眠异常会增加房颤风险，但具体机制仍有待深入探索。

褪黑素（melatonin，MLT）因抗氧化等特性对多种疾病有治疗潜力，在抗心律失常方面也有作用，不过在肥胖人群中却可能增加房颤易感性，作用机制尚不明确。心肌细胞钙动力学对心脏至关重要，钙稳态失衡与房颤紧密相连。本研究旨在探究MLT能否通过降低线粒体氧化应激等，减轻睡眠剥夺引发的大鼠房颤，为睡眠相关心律失常治疗提供新方向。

基于此，新疆医科大学第一附属医院汤宝鹏教授团队近期在International Immunopharmacology杂志上发表"Melatonin lessens the susceptibility to atrial fibrillation in sleep deprivation by ameliorating Ca²⁺ mishandling in response to mitochondrial oxidative stress"的相关文章。

文中首次提供了MLT减轻SD诱导的AF易感性的证据。这种作用是通过抑制ox-CaMKII/RYR2介导的RyR2相关的肌浆网钙积累来实现的。此外，MLT通过调节与氧化应激相关的纤维化、炎症和凋亡来减少心房结构重构。虽然这些发现揭示了MLT的潜在抗心律失常途径，但具体的作用机制还需要进一步实验验证。

研究方法：
本文采用多通道电生理标测技术（Electrical Mapping）分别检测Control组、SD组、SD+MLT组大鼠的有效不应期、传导速度、传导速度离散度等指标，此外，还应用了高分辨荧光标测技术（Optical Mapping）来检测Control组、SD组、SD+MLT组大鼠离体心脏的动作电位以及钙瞬变信号的变化。

研究结果：
1. MLT减轻了SD诱导的心房电重构
为了研究房颤的易感性，我们应用S1-S1刺激评估不同组大鼠房颤易感性，应用S1-S2刺激来测量心房的有效不应期（AERP）。结果表明，SD后房颤的诱发率和持续时间增加，而MLT给药可缓解这些影响；值得注意的是，与对照组相比，SD显著缩短了心房有效不应期（AERP），而MLT治疗后AERP恢复。此外，SD显著减缓心房心外膜电传导速度，增加左心房电传导不均一性，而MLT治疗有效地逆转了这些变化，这提示外源性MLT可能抵消了睡眠剥夺引起的不良心脏电生理改变。（图1）

图1 MLT减轻了SD诱导的心房电重构

2. MLT减轻了SD诱导的心房结构重构
除了电生理学的改变外，我们还研究了MLT在缓解睡眠剥夺引起的心房结构重构中的作用。超声心动图显示，MLT减轻了睡眠剥夺引起的左心房增大。然而，其他超声心动图参数，如LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS和rad，在对照组和睡眠剥夺组之间，无论有无MLT，都没有显著差异。HE染色的组织学分析显示，睡眠剥夺组大鼠的心肌横截面积和心肌细胞肥大增加，而MLT可减轻这些症状。Masson三色染色显示，与对照组相比，MLT降低了睡眠剥夺大鼠心肌纤维化。考虑到心肌细胞凋亡可导致心肌纤维化，我们采用TUNEL染色法评价MLT对心房肌细胞凋亡的保护作用，结果显示，睡眠剥夺显著增加了心肌细胞的凋亡，而MLT处理则减轻了这种作用。综上所述，这些发现表明睡眠剥夺诱发心房结构重构，而MLT可能提供潜在的治疗益处。（图2）

图2 褪黑素可减轻SD诱导的心房结构重构

3. MLT可能通过影响钙信号传导和氧化应激来改善AF的易感性
在基于网络药理学的分析中，利用CTD、DisGeNET、药物库、基因卡和OMIM等数据库，筛选出与AF、SD和MLT相关的靶点。随后，使用Cytoscape分析蛋白质-蛋白质相互作用网络，应用置信评分阈值为0.9，得到100个关键靶点。

随后对核心靶标进行了富集分析。KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集分析确定了显著的通路，包括钙信号通路、凋亡和PPAR信号通路，生物通路富集分析强调了其在钙离子转运、细胞内钙稳态和线粒体过程中的作用。关键分子功能与蛋白激酶活性和钙通道活性相关，而细胞成分主要与内质网和线粒体膜相关。综上所述，我们假设MLT可能会通过影响线粒体氧化应激和钙信号通路降低睡眠时对房颤的易感性。

Western blot分析表明，睡眠剥夺诱导了心房Ca²⁺处理蛋白的修饰，特别是RyR2在Ser2814位点的磷酸化水平的增加和CaMKII的氧化。与此相反，睡眠剥夺大鼠心房中SERCA和NCX的表达水平降低，而这些改变在MLT治疗后被逆转。此外，通过DHE-red染色和MDA水平的升高以及SOD的降低证明睡眠剥夺导致了氧化应激的增加；而MLT能有效地缓解这些影响。这些结果表明，MLT可能通过调节钙水平和降低氧化应激从而降低睡眠剥夺诱发的房颤的风险。（图3） 

图3 褪黑素可能通过影响钙信号传导和氧化应激来改善SD诱导的AF易感性

4. MLT改善了睡眠剥夺大鼠的心房钙信号异常
应用高分辨荧光标测技术评估Control组、SD组、SD+MLT组大鼠心房钙信号变化。实验结果表明，MLT逆转了SD诱导的CaD（钙瞬变时程）延长。CaD的不同复极化阶段揭示了Ca²⁺动力学启动、释放和衰退的连续阶段。传导热图显示了四个位点在不同复极化阶段的CaD。与对照组和治疗组相比，睡眠剥夺促进了CaD从CaD20延长到CaD90，并增加了CaD的空间离散性和不均匀性。值得注意的是，这种睡眠剥夺导致的峰值时间延迟在MLT治疗后得到缓解，强调了其对心房Ca²⁺稳态的有益影响。（图4）

图4 MLT改善了SD大鼠心房Ca²⁺处理异常

5. MLT改善了睡眠剥夺大鼠的APD（动作电位时程）异常
与观察到的睡眠剥夺大鼠钙动力学改变一致，我们的研究结果还显示了心房APD的显著延长，以及到峰值的激活时间的延长，同时伴随着APD的空间离散度和变异系数的增加。值得注意的是，这些异常的电生理指标在MLT治疗后得到了显著的改善。

6. MLT改善了睡眠剥夺大鼠的心房传导特性
给予S1-S1刺激后，与对照组相比，MLT改善了SD诱导的APD和CaD的异位活性。此外，MLT显著提高了睡眠剥夺大鼠的传导速度，并降低了其异质性。（图5）

7. MLT减轻了心房CaT（钙瞬变时程）、APD和空间上不一致的交替反应的发生
复极化离散度和钙瞬变信号不一致性与致心律失常相关。使用S1-S1刺激方案，实验结果表明，睡眠剥夺的大鼠比对照组表现出更多的心房CaT和APD交替，表明心律失常的风险更高，而MLT治疗显著缓解了这一现象，特别是在较短的周期长度（80和60ms），提示其对心律失常的治疗潜力。

空间不一致交替（SDA）反映了心脏不均匀的复极化，通常发生在较短的周期长度。这导致心房区域的CaT交替振幅不同，有些区域出现较大的波动，有些区域波动较小。在睡眠剥夺的大鼠中，SDA随着起搏间隔从100ms减少到80-60ms而增加。在这些时间间隔内，SDA在睡眠剥夺的大鼠中比在对照组中更常见。MLT在这些关键时间间隔降低了SDA的发生率，表明其在减少睡眠剥夺导致的致心律失常风险方面具有潜在的治疗作用。（图6）

图6 MLT减轻了SD大鼠中CaT-、APD-和空间不一致交替的发生

8. MLT改善SD大鼠心房RyR不应期
S1刺激诱发了心房肌细胞内Ca²⁺释放。额外的S2刺激可以使下一个Ca²⁺瞬态在正常状态下达到相当大的振幅。当S1脉冲诱导细胞内Ca²⁺瞬变时，S2诱导的CaT与之前S1诱导的CaT的比值被确定为CaT不应期，也称为RyR2不应期。图中展示了S1刺激与最终S2刺激吻合后的CaT波形。热图显示了四个区域的RyR2不应期的空间差异性随S1-S2区间递减而加剧。这些热图还表明，MLT显著减轻了睡眠剥夺大鼠的CaT恢复比率的空间异质性。同时，与Control组相比，睡眠剥夺延长了S2间隔为60至90毫秒的CaT恢复时间，而MLT有效缓解了这一现象。此外，CaT恢复率的变异系数，在睡眠剥夺大鼠的心房中更高，但在MLT治疗后降低，表明各区域钙释放恢复的均匀性增强。（图7）

图7 MLT改善SD大鼠心房RyR不应期

9. 外源性MLT干预作用减弱了H₂O₂诱导的HL-1细胞的氧化应激和线粒体功能障碍倾向
网络药理学分析表明，MLT可能通过减轻氧化应激和线粒体损伤来改善睡眠剥夺引起的心房重构。先前的Western blot分析表明，在不同的研究组中，CaMKII氧化和相关的钙处理蛋白表达水平存在显著差异。此外，荧光标测结果显示，MLT纠正了大鼠睡眠剥夺模型中异常的心房Ca²⁺稳态，这表明MLT的作用可能扩展到减少CaMKII氧化和钙处理正常化，从而降低睡眠剥夺诱导心房颤动的风险。为了验证这些发现，我们使用特异性氧化CaMKII抑制剂KN93作为阳性对照组进行了体外实验。实验结果表明，这些药物对H₂O₂引发的线粒体氧化损伤有显著的保护作用，这可以从MitoSOX-Red和cellrox-绿色荧光的降低得到证明。此外，从JC-1聚集/单体比例的增加推断，两种处理均能通过下调Fis1表达抑制DRP1寡聚化和Ser616磷酸化，提高MFN1和MFN2水平，增强DRP1在Ser637位点的磷酸化来恢复线粒体膜去极化。以上结果支持了MLT减轻HL-1细胞氧化应激和线粒体功能障碍的假说。（图8）

图8 外源性MLT干预可减轻H₂O₂诱导的氧化应激和线粒体功能障碍

10.  MLT抑制氧化应激诱导的Ca²⁺处理异常和CaMKII氧化
为了阐明MLT对CaMKII氧化翻译后修饰和细胞内钙调节的影响，我们使用Fluo-4 AM探针监测HL-1细胞中细胞内Ca²⁺水平。研究结果显示，平均荧光强度显著升高，表明H₂O₂刺激细胞内Ca²⁺水平升高。经MLT和CaMKII氧化抑制剂KN93处理后，这种作用得到缓解。此外，使用Rhod-2荧光探针监测到H₂O₂暴露后线粒体中Ca²⁺的积累加剧而MLT和KN93处理都有效地减弱了这种病理状态。这表明MLT和KN93可能抑制线粒体Ca²⁺超载。随后对钙处理蛋白的分析显示，过氧化氢暴露增强了CaMKII的氧化和激活，以及随后的下游靶点-NCX和RyR2 Ser2814的磷酸化，从而下调了SERCA2α（肌浆网 Ca²⁺再摄取的重要转运体）的表达。值得注意的是，MLT和KN93显著地抵消了这些变化。这提示MLT可能通过减轻氧化应激和恢复钙处理稳态来降低与睡眠剥夺相关的房颤易感性。（图9）

图9 MLT抑制氧化应激诱导的Ca²⁺处理异常和CaMKII氧化

本研究提出了几个重要的发现：(1) MLT缓解了SD诱导的心房电重构，包括AERP逆转，降低了房颤诱发率和持续时间；(2) MLT减轻了SD诱导的心房结构重构，包括心房间质纤维化、凋亡和炎症；(3) MLT改善在APD和CaD的改变以及传导异常；(4) MLT改善致心律失常交替，增强心房RyR不应性；(5) MLT抑制氧化应激诱导的 Ca²⁺处理异常和CaMKII氧化。目前，这是第一个证明MLT在睡眠剥夺的情况下发挥抗心律失常作用的研究。（图10）

图10 MLT改善睡眠剥夺过程中房颤易感性的机制示意图