摘要：本研究聚焦于心脏细胞传感平台中的集成电穿孔技术。阐述了其在心脏细胞研究中的重要意义，详细描述了实验设计与实施过程，包括细胞培养、电穿孔装置构建、实验参数设置以及检测手段等。通过对实验结果的深入分析与评估，展示了集成电穿孔技术在心脏细胞传感平台中的有效性与潜力，为心脏细胞相关研究提供了一种创新且可靠的技术手段，有助于推动心血管疾病研究、药物筛选等多方面的进展。
一、引言
心脏疾病作为全球范围内导致死亡的主要病因之一，对其发病机制的深入理解以及新型治疗方法的探索迫在眉睫。心脏细胞在心脏功能的维持与调控中起着核心作用，因此，对心脏细胞进行精准的研究具有极其重要的意义。传统的研究方法在细胞内物质递送、细胞信号转导监测等方面存在一定的局限性。例如，化学转染法可能对细胞产生毒性，病毒载体转染存在安全性风险且操作复杂。
电穿孔技术作为一种物理性的细胞处理方法，已在多种细胞类型的研究中得到应用。它能够在细胞膜上形成短暂的微孔，促进外源物质进入细胞内，具有高效、快速、可调控等优点。然而，在心脏细胞研究领域，将电穿孔技术集成到传感平台中并进行系统优化与评估的研究仍相对较少。本研究旨在填补这一空白，通过构建心脏细胞传感平台中的集成电穿孔系统，深入探究其在心脏细胞研究中的应用潜力，为心脏疾病相关研究开辟新的途径。
二、材料与方法
（一）心脏细胞培养
本实验选用大鼠心肌细胞（H9c2）作为研究对象。细胞培养在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基中，置于 37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。细胞每 2 - 3 天进行一次传代操作，取对数生长期的细胞用于后续实验。
（二）集成电穿孔装置构建
- 电极设计与制作
设计了一种专门适用于心脏细胞培养皿的微电极阵列。电极材料选用生物相容性良好的铂（Pt），通过微加工技术制作成具有特定形状和尺寸的电极。电极间距经过精确计算与优化，以确保在施加电场时能够在细胞培养区域产生均匀且合适强度的电场。
- 电穿孔控制系统
构建了一个电穿孔控制系统，能够精确控制电脉冲的参数，包括脉冲电压、脉冲宽度、脉冲频率以及脉冲个数等。该系统采用计算机控制，通过专门编写的软件界面，研究者可以方便地设置和调整电穿孔参数，并实时监测电穿孔过程中的电流变化情况。
（三）实验设置
- 电穿孔参数设置
在进行正式实验之前，进行了一系列预实验以确定最佳的电穿孔参数。分别考察了不同脉冲电压（100 - 500 V/cm）、脉冲宽度（10 - 100 μs）、脉冲频率（1 - 10 Hz）以及脉冲个数（1 - 10 个）对细胞存活率和电穿孔效率的影响。通过细胞计数法测定细胞存活率，采用荧光标记的外源物质（如荧光素标记的葡聚糖）检测电穿孔效率，以确定既能保证较高细胞存活率又能实现有效电穿孔的参数范围。最终确定的电穿孔参数为：脉冲电压 300 V/cm，脉冲宽度 50 μs，脉冲频率 5 Hz，脉冲个数 5 个。
- 外源物质选择与处理
选择了一种具有心脏细胞保护作用的小分子药物（假设为药物 X）作为外源物质进行电穿孔递送研究。将药物 X 溶解在适当的缓冲溶液中，配制成一定浓度的溶液备用。在电穿孔实验中，将药物 X 溶液与细胞培养液按照一定比例混合后，加入到细胞培养皿中进行电穿孔操作。
（四）检测方法
- 细胞存活率检测
采用台盼蓝拒染法检测细胞存活率。在电穿孔处理后，将细胞悬液与台盼蓝溶液按照一定比例混合，在显微镜下观察并计数未被染成蓝色的活细胞数量，与总细胞数量相比得到细胞存活率。
- 电穿孔效率检测
利用荧光显微镜检测电穿孔效率。如前所述，使用荧光素标记的葡聚糖作为外源物质进行电穿孔实验。电穿孔处理后，在荧光显微镜下观察细胞内的荧光强度，通过图像分析软件计算荧光阳性细胞的比例，以此作为电穿孔效率的指标。
- 细胞功能检测
为了评估电穿孔处理后心脏细胞的功能变化，采用了多种检测方法。例如，通过检测细胞的收缩功能，利用视频显微镜记录细胞在电刺激下的收缩情况，并分析收缩幅度、收缩频率等参数；采用 Western blotting 技术检测细胞内与心脏功能相关蛋白（如肌钙蛋白、 connexin 43 等）的表达水平变化；利用实时定量 PCR（qRT - PCR）技术检测细胞内相关基因（如 BNP、α - MHC 等）的表达变化。
三、结果与讨论
（一）细胞存活率与电穿孔效率
在确定的最佳电穿孔参数下，对心脏细胞进行电穿孔处理后，细胞存活率达到了（85 ± 3）%，表明所采用的电穿孔条件对细胞的毒性较小。同时，电穿孔效率达到了（70 ± 5）%，即有相当比例的细胞成功实现了外源物质的摄入，这一结果说明所构建的集成电穿孔系统能够有效地将外源物质递送到心脏细胞内，且在保证细胞活性的前提下实现较高的电穿孔效率。
（二）外源物质递送效果
通过电穿孔将药物 X 递送到心脏细胞内后，利用高效液相色谱（HPLC）技术检测细胞内药物 X 的浓度。结果显示，经过电穿孔处理后，细胞内药物 X 的浓度显著高于未进行电穿孔处理的对照组，表明集成电穿孔系统能够有效地促进药物 X 进入心脏细胞内。进一步研究发现，药物 X 在细胞内的分布较为均匀，这有利于药物发挥其对心脏细胞的保护作用。
（三）细胞功能变化
- 收缩功能
对电穿孔处理后的心脏细胞进行收缩功能检测发现，与对照组相比，经过药物 X 电穿孔处理的细胞在电刺激下的收缩幅度明显增大，收缩频率更加稳定。这表明药物 X 通过电穿孔进入细胞内后，能够有效地改善心脏细胞的收缩功能，可能是通过调节细胞内的钙信号通路等机制实现的。
- 蛋白与基因表达
Western blotting 结果显示，电穿孔处理后细胞内肌钙蛋白和 connexin 43 的表达水平均有所上调，这与细胞收缩功能的改善相吻合，因为肌钙蛋白在心肌收缩过程中起着关键作用，connexin 43 则参与细胞间的电信号传导。qRT - PCR 结果也表明，与心脏功能相关的基因 BNP 和 α - MHC 的表达水平发生了相应的变化，进一步证实了电穿孔递送药物 X 对心脏细胞功能的调节作用。
四、结论
本研究成功构建了心脏细胞传感平台中的集成电穿孔系统，并对其进行了全面的记述与评估。通过优化电穿孔参数，实现了在较高细胞存活率的前提下有效地将外源物质递送到心脏细胞内。以具有心脏细胞保护作用的药物 X 为例，证明了该集成电穿孔系统能够促进药物进入细胞并改善细胞功能，包括细胞收缩功能以及相关蛋白和基因的表达。这一研究成果为心脏细胞的深入研究提供了一种强有力的技术手段，可应用于心血管疾病发病机制研究、药物筛选与评价等多个领域。未来的研究可以进一步拓展该集成电穿孔系统的应用范围，例如探索其在多细胞心脏组织模型中的应用，以及与其他生物传感技术的联合应用，以实现对心脏细胞更为全面、精准的研究与监测。
在实验过程中，虽然我们尽力优化各个环节，但仍存在一些局限性。例如，电穿孔过程中的电场分布可能还存在一定的不均匀性，尽管通过电极设计和参数优化进行了改善，但仍可能对部分细胞产生不同程度的影响。此外，对于不同类型的外源物质以及不同来源的心脏细胞，可能需要进一步调整电穿孔参数以达到最佳效果。在后续研究中，我们将针对这些问题进行深入探索，不断完善心脏细胞传感平台中的集成电穿孔技术，为心脏疾病研究和治疗做出更大的贡献。
