基于微流控技术探究动态核酸杂交奥秘
一、引言
二、材料与方法
（一）微流控芯片设计与制作
（一）微流控芯片性能评估
（一）微流控芯片设计与制作
- 芯片设计
设计了一种具有多层结构的微流控芯片，芯片上层为样品混合与反应通道，通道宽度设计为 50 - 200 μm，深度为 20 - 50 μm，以确保反应体系在微尺度下能够实现高效的物质混合与扩散。下层为温度控制通道，通过循环水或热空气流来精确调控反应通道内的温度，温度控制精度可达 ±0.1°C。在芯片的入口处设计了微注射口，用于精确注入核酸样品、缓冲液以及其他试剂。 - 芯片制作
采用软光刻技术制作微流控芯片模具。首先，在硅片上旋涂一层厚度为 2 - 5 μm 的光刻胶，然后利用电子束光刻或紫外光刻技术将设计好的芯片图案转移到光刻胶层上。经过显影、刻蚀等工艺，在硅片上形成具有微通道结构的模具。接着，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与固化剂按照 10:1 的比例混合均匀，脱气后倒入硅片模具中，在 70 - 80°C 下固化 2 - 4 小时。固化后的 PDMS 芯片从模具上剥离，打孔后与玻璃基底进行等离子键合，形成密封的微流控芯片。
- 核酸序列设计与合成
设计了一系列具有不同长度和碱基组成的核酸探针序列，包括与目标核酸序列完全互补的探针以及含有单个或多个碱基错配的探针。这些核酸序列由专业的生物工程公司合成，合成后的核酸经过高效液相色谱（HPLC）纯化，以确保其纯度和质量。 - 核酸标记
采用荧光染料对核酸探针进行标记，以便于后续的荧光成像检测。选择了具有较高荧光量子产率和光稳定性的荧光基团，如 Cy3、Cy5 等。标记过程按照荧光染料的使用说明书进行操作，通过化学反应将荧光基团共价连接到核酸探针的特定位置，标记效率经过荧光光谱仪检测，确保标记效率达到 90% 以上。
- 流体驱动系统
采用高精度注射泵作为流体驱动装置，能够精确控制流体的流速，流速范围为 0.1 μL/min - 100 μL/min。通过连接微流控芯片的入口和注射泵，将核酸样品、缓冲液等试剂按照设定的流速注入到芯片的反应通道中。 - 温度控制系统
温度控制系统由恒温循环水浴、温度传感器和控制器组成。恒温循环水浴能够提供稳定的热水或冷水流，通过温度传感器实时监测芯片反应通道内的温度，并将信号反馈给控制器。控制器根据设定的温度值自动调节循环水浴的流速和温度，以确保反应通道内的温度始终保持在设定范围内。 - 荧光成像系统
荧光成像系统采用倒置荧光显微镜，配备高灵敏度的荧光检测器和冷却型 CCD 相机。显微镜的物镜具有高数值孔径，能够提供高分辨率的荧光图像。在实验过程中，通过激发荧光染料的特定激发波长，收集发射波长的荧光信号，利用 CCD 相机记录荧光图像，并通过图像采集软件实时采集和存储图像数据。
- 芯片预处理
在进行实验前，将制作好的微流控芯片用去离子水冲洗 3 - 5 次，然后用氮气吹干。接着，将芯片放入 70% 乙醇溶液中浸泡 10 - 15 分钟进行消毒处理，最后用无菌去离子水再次冲洗 3 次，以去除残留的乙醇。 - 样品注入与反应
将荧光标记的核酸探针和目标核酸溶液分别用缓冲液稀释至合适的浓度，然后通过注射泵将探针溶液和目标核酸溶液以相同或不同的流速注入到微流控芯片的反应通道中。在注入过程中，通过温度控制系统将反应通道内的温度设定为所需的杂交温度，如 37°C、45°C 等。同时，通过改变缓冲液的组成来调节反应体系中的离子强度，如添加不同浓度的 NaCl 溶液。 - 荧光成像与数据采集
在核酸杂交反应进行过程中，利用荧光成像系统每隔 10 - 30 秒采集一次荧光图像，记录荧光信号的强度变化。实验持续时间根据核酸杂交的预期动力学过程而定，一般为 10 - 60 分钟。采集到的荧光图像数据通过图像分析软件进行处理，计算荧光强度随时间的变化曲线，从而得到核酸杂交的动力学曲线。
（一）微流控芯片性能评估
- 流体操控精度
通过注射泵向微流控芯片注入不同流速的荧光染料溶液，利用荧光显微镜观察溶液在芯片通道内的流动情况，并测量染料溶液的实际流速。结果表明，注射泵能够精确控制流体流速，实际流速与设定流速的偏差在 ±5% 以内，说明微流控芯片的流体操控系统具有较高的精度。 - 温度控制稳定性
在不同的设定温度下，利用温度传感器监测微流控芯片反应通道内的温度变化。实验结果显示，温度控制系统能够将反应通道内的温度稳定在设定温度 ±0.1°C 范围内，即使在外界环境温度波动较大的情况下，也能保持良好的温度稳定性，为核酸杂交反应提供了稳定的温度环境。
- 杂交速率与温度的关系
在不同的杂交温度下（30°C - 50°C），对完全互补的核酸探针与目标核酸的杂交过程进行了研究。结果表明，随着温度的升高，核酸杂交的初始速率逐渐增加，但当温度超过一定值（如 45°C）后，杂交速率开始下降。这是因为在较低温度下，核酸分子的热运动相对较慢，碱基配对的速率较低；而在过高温度下，核酸双链的稳定性下降，导致杂交效率降低。通过对实验数据进行拟合，得到了核酸杂交速率与温度之间的定量关系，为优化核酸杂交反应温度提供了理论依据。 - 杂交特异性研究
对比了完全互补核酸探针与含有单个碱基错配的核酸探针在相同条件下的杂交动力学过程。实验结果显示，完全互补探针的杂交速率明显快于错配探针，且最终的杂交信号强度也更高。这表明微流控技术能够有效提高核酸杂交的特异性，减少非特异性杂交的发生。通过进一步分析不同错配位置和错配碱基类型对错配探针杂交动力学的影响，发现错配碱基位于探针中间位置时对杂交的影响较大，而不同类型错配碱基（如 A - T 错配与 G - C 错配）的影响程度也有所差异。
