MLKL在激动剂诱导血小板促血栓形成和溶解细胞死亡研究机制详解
浏览次数：850 发布日期：2024-8-26
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前言：血小板是来源于巨核细胞的无核循环细胞，以其在止血和血栓形成中的核心作用而闻名。尽管血小板通过封闭受伤血管内皮的缺口有助于防止失血，但它们也可能是缺血性中风和心肌梗死等危及生命的血管闭塞性疾病的原因。血小板在诱导剂激活后，经历强烈的代谢重组并执行能量密集型活动，而未被诱导剂激活的血小板的寿命（人类血小板一般为7-14天）是由血小板凋亡机制所决定的。坏死是一种程序性坏死性凋亡，可被细胞外信号（死亡受体-配体结合）或细胞内诱因（微生物核酸）所诱导。RIPK（受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）1、RIPK3和MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白）是参与坏死性凋亡的主要分子。MLKL作为RIPK1和RIPK3下游的效应蛋白，是坏死性凋亡的末端效应分子。在坏死性凋亡期间，MLKL被RIPK3磷酸化激活，发生寡聚化，并与磷脂酰肌醇相互作用，诱导膜通透，最终损害细胞膜的完整性，导致细胞死亡。尽管有研究表明，使用巨核细胞（血小板的祖细胞）特异性敲除MLKL的小鼠，其尾部再出血时间延长，激动剂诱导的血小板活化受损；但MLKL在人类血小板中的调节作用在很大程度上仍未被探索。为此，来自印度贝拿勒斯印度教大学（Banaras Hindu University, Varanasi, India）医学院的科学家于2023年在Nature出版集团旗下期刊《Cell Death & Differentiation》杂志上发表题为《Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist- induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order》的研究论文。
摘要：坏死性凋亡是一种主要由RIPK1、RIPK3和MLKL分子执行的程序性细胞死亡形式。血小板是在止血和病理性血栓形成中发挥核心作用的循环细胞。在这项研究中，作者证明了MLKL在激动剂刺激血小板活化过程中分子作用机制的开创性贡献，最终在时间尺度上发展为坏死性凋亡。生理激动剂如凝血酶（Thrombin）以RIPK3独立但磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT依赖的方式刺激血小板中MLKL磷酸化和随后的寡聚。抑制MLKL显著抑制了激动剂诱导的血小板止血反应，包括血小板聚集、整合素(αIIbβ3)激活、颗粒分泌、促凝剂(PS)表面生成、细胞内钙升高、细胞外小泡脱落、血小板-白细胞相互作用和血流剪切力下血栓形成。抑制MLKL也促使受刺激血小板中线粒体氧化磷酸化和有氧糖酵解受损，同时伴有线粒体跨膜电位的破坏、质子泄漏增加、线粒体钙和ROS下降。这些发现强调了MLKL在维持氧化磷酸化和有氧糖酵解中的关键作用，这是能量密集型血小板活化反应的基础。长时间暴露于凝血酶将引起MLKL寡聚和易位至质膜，导致细胞膜逐渐通透和血小板活力下降，PI3K/MLKL抑制剂可阻止这种情况的发生。总之，MLKL在激动剂诱导的血小板从相对静止转变为功能/代谢活跃的促血栓形成以及随后发展为坏死性调亡方面发挥着至关重要的作用。
结果：尽管血小板是无核细胞，但血小板在能量代谢方面很活跃，其能量代谢系统可以通过有氧糖酵解和线粒体氧化磷酸化供能，使血小板在不同情况下满足不同功能状态的能量需求。由于MLKL在激动剂诱导的血小板活化中发挥着关键作用，而血小板活化需要消耗大量的能量，那么MLKL对维持血小板高能量代谢状况的作用又是如何呢？由于大多数人类有核细胞含有数百甚至数千个线粒体，而无核细胞血小板一般仅有5-8个线粒体，血小板含有的线粒体数量相对于常规含核细胞不到1%，这就要求进行线粒体能量代谢检测时，血小板样品数量是常规细胞数量的百倍以上，如果线粒体能量代谢检测方法中样品孔检测体积较小时（如只有几微升检测体积），就需要花大量时间进行血小板数量梯度摸索，而奥地利Oroboros高精度氧化磷酸化功能表征系统具有0.5-3.5ml大样品检测仓体积、样品无需贴壁处理及快速进行线粒体功能差异表征的技术特点，非常适合检测含线粒体数量很少的血小板样品；通过奥地利Oroboros高精度氧化磷酸化功能表征系统对血小板线粒体功能进行表征分析，作者发现用NSA（MLKL抑制剂）预孵育组和未添加NSA的对照血小板（DMSO）组相比，耗氧率（Oxygen Consumption rate）几乎没有变化；添加凝血酶（Thrombin）后，发现NSA处理组耗氧率激增量显著低于DMSO对照组，说明MLKL促进了线粒体电子传递的作用；添加寡霉素（Oligomycin，复合体V抑制剂）后，发现NSA处理组耗氧率降低量显著低于DMSO对照组，表明NSA处理组的氧化磷酸化（OXPHOS）水平显著低于DMSO对照组，说明在NSA存在的情况下，凝血酶诱导的血小板OXPHOS功能显著受损；同时也发现添加寡霉素后，NSA处理组质子泄漏（Proton leak）水平显著高于DMSO对照组，由于质子泄漏代表不依赖于复合体V的质子驱动的氧气消耗，表明MLKL对线粒体内膜的稳定作用，抑制质子泄漏；以上数据表明MLKL对维持血小板线粒体正常功能运行具有重要作用。
讨论：虽然血小板在防止血管损伤时意外失血方面发挥着至关重要的作用，但过度活跃的血小板与急性心肌梗死和缺血性中风等严重血栓形成有关。因此，必须彻底了解血小板活化的机制，以设计有效的抗血栓性疾病的治疗策略。鉴于MLKL在血小板生理学中的重要作用，它可能是一个治疗血栓性疾病的潜在靶点。
参考文献：Ekhlak, M., Kulkarni, P.P., Singh, V. et al. Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist-induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order. Cell Death Differ 30, 1886–1899 (2023). https://doi.org/10.1038/s41418-023-01181-6.
