细胞复苏实验的详细过程说明
细胞复苏是通过快速融化的手段保证细胞外结冰晶在很短时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞重新结晶对细胞造成损害，复苏成功的细胞可以保持很高的活力。细胞复苏的过程需要严格的温度控制，以确保细胞的活力和完整性。一旦温度过高或过低，都可能对细胞造成不可逆的损伤，影响实验的顺利进行。在操作过程中，科学家们必须全神贯注，如同呵护脆弱的生命之花。
细胞复苏的原则：快速融化
必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
实验前准备：
1.将水浴锅提前预热至37℃。
2.细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。
一、取出冻存管
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
二、迅速解冻
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断地摇动，使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
三、平衡离心
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。
四、制备细胞悬液
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入适量完全培养液，吹打制成细胞悬液。
3.用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。
五、细胞计数
细胞浓度以5×105/mL为宜。
六、培养细胞
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。
七、记录复苏日期
八、结果分析：
判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。
如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。
注意事项：
1. 实验前做好准备工作，如预热水浴锅、配制并预热培养基、实验器材的准备。确保避免因实验准备不充分导致细胞复苏失败。
2. 取细胞时应做好防护措施，带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
3. 若液氮罐距离水浴锅距离较远，需要对冻存管进行保冷后转移到水浴锅旁，避免路途中导致细胞融化。可用-80℃预冷的程序降温盒转移细胞，但不可长时间滞留，应尽快化冻复苏。
4. 细胞放入水浴中注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，并防止水浴时水进入细胞冻存管污染细胞。打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。
5. 若细胞较珍贵，在吸取细胞时要保留枪头或移液管，用培养基冲洗上面残留的细胞。
6. 快速操作的目的：一是防止长时间常温下DMSO对细胞产生毒性；二是在低温到常温的过程中，水分会重新进入细胞并形成冰晶，快速升温可以使冰晶迅速融化，避免伤害细胞。
7. 离心的主要目的是通过换液取出含有DMSO的冻存液，若细胞对DMSO耐受，可不离心。
细胞复苏的原则：快速融化
必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
实验前准备：
1.将水浴锅提前预热至37℃。
2.细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。
一、取出冻存管
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
二、迅速解冻
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断地摇动，使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
三、平衡离心
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。
四、制备细胞悬液
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入适量完全培养液，吹打制成细胞悬液。
3.用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。
五、细胞计数
细胞浓度以5×105/mL为宜。
六、培养细胞
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。
七、记录复苏日期
八、结果分析：
判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。
如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。
注意事项：
1. 实验前做好准备工作，如预热水浴锅、配制并预热培养基、实验器材的准备。确保避免因实验准备不充分导致细胞复苏失败。
2. 取细胞时应做好防护措施，带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
3. 若液氮罐距离水浴锅距离较远，需要对冻存管进行保冷后转移到水浴锅旁，避免路途中导致细胞融化。可用-80℃预冷的程序降温盒转移细胞，但不可长时间滞留，应尽快化冻复苏。
4. 细胞放入水浴中注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，并防止水浴时水进入细胞冻存管污染细胞。打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。
5. 若细胞较珍贵，在吸取细胞时要保留枪头或移液管，用培养基冲洗上面残留的细胞。
6. 快速操作的目的：一是防止长时间常温下DMSO对细胞产生毒性；二是在低温到常温的过程中，水分会重新进入细胞并形成冰晶，快速升温可以使冰晶迅速融化，避免伤害细胞。
7. 离心的主要目的是通过换液取出含有DMSO的冻存液，若细胞对DMSO耐受，可不离心。
