细胞冻存步骤及冻存原代细胞的培养
原代细胞(primary culture cell)是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA，RNA和遗传学研究等。
一、细胞冻存实验步骤：
1. 制备冻存液，冻存液比例：本实验室采用70%基础培养基+20%FBS+10%DMSO，不同实验室及不同细胞可能略有差异，也可采用55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO；
2. 取形态良好，处于对数生长期的细胞，对其消化、离心 (1500rpm离心8min)、计数；
3. 根据细胞数量加入对应的冻存液，使细胞密度维持在300-500w/mL；
4. 小心用镊子打开冻存管管盖，每管分装1-1.5mL含细胞的冻存液，拧紧盖管，做好标记。
5. 分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放-80℃过夜；
6. 若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃20min→-20℃30min→-80℃过夜，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；
7. 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。
二、冻存原代细胞的培养：
1.将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。
2.将冻存管快速的放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体*融化。
3.将冻存管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。
4.用70%的酒精冲洗冻存管，然后擦去多余酒精。
5.打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹(注意，由于冻存管有负压，开盖时可能会有少量溢出，这是正常现象)。
6.用多聚赖氨酸包被培养瓶。多数细胞推荐的接种密度为每平方厘米5000个细胞。
7.盖好培养瓶的盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。
8.将培养瓶放入培养箱中。
9.放入培养箱后第6-16小时更换一次培养基，以去除残留的二甲基亚枫和未贴壁的细胞。
三、原代细胞的组织块培养法：
1.组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2.加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3.当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。
4.为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。
