深度解析旷场实验的发展、原理及应用

一、背景和历史概述 

旷场测试（OFT）是一种常用的测量啮齿动物探索行为和一般活动的方法，其中可以测量活动的质量和数量。Hall被广泛认为是首次引入OFT的人。虽然最初的研究是在大鼠中进行的，但OFT也在小鼠中得到了广泛的应用。除了总移动距离，还分析了移动的许多特性。这些包括在墙壁（触壁性）和中心的时间，不同时间段的移动距离，以及后腿直立。此外，OFT有时被用作评估一般活动水平的“控制”实验，用于涉及活动的其他行为测试。

OFT也常用于评估化合物的镇静、毒性或刺激效果。因此，该测试有许多用途，几乎包含在对啮齿动物行为的每一次全面分析中。主要来说，旷场（OF）是一个围场，通常是方形、矩形或圆形，周围有防止逃逸的墙壁（图1.1）。因此，OFT通常不使用“场”这个词的真正意义，即一个宽阔、开阔的区域，动物可以在其中移动和行为自如，而是一个旷场，对于小鼠来说，通常会从25平方厘米变化到超过250平方厘米。虽然有一些例外，但在几乎所有的实验设计中，小鼠都是由研究者放入旷场的，因此被迫与新环境互动。在解释结果时应考虑这种强制进入，因为动物并不主动寻求进入旷场。传统的OFT持续时间在2到10分钟之间。这段短时间强调了探索行为和对新奇事物的反应，而不是基线活动。这段短时间（在早期研究中使用）是由于许多原因，包括手动获取数据的方法。更近期的方法，包括视频跟踪和通过红外线束断裂次数的跟踪，允许更高的吞吐量和更长时间的监控。
 

图1 旷场箱模型 

移动距离、移动时间、后腿直立和活动随时间的变化都是可以计算和报告的测量。还有许多其他不常报告的测量，包括不移动的时间、嗅探、发声和牙齿打颤（参见Walsh和Cummins（7）对OFT依赖性测量的全面审查）。最近，特别是随着高吞吐量方法的出现和对行为研究中单一结果的关注，报告的变量数量通常有所减少。然而，已经有努力包括可以由计算机系统评估的许多变量，包括飞奔、路径的纹理、活动密度和包括伦理测量和常规变量的主成分分析。总的来说，我们在这一章中并没有详细讨论这些不常监测的结果。此外，我们也没有详细讨论进行因子分析或定义因子之间关系的方法。

最基本和常见的关注结果是“运动”，然而，这可能受到运动输出、探索驱动、僵直（或其他恐惧相关行为）、疾病、昼夜周期中的相对时间以及其他各种变量的影响。重要的是，旷场测试（OFT）（尤其是单次短时间测试）并不是基线或自发活动的准确代理，这只能通过在鼠类适应的环境中或在家庭笼中进行更长时间的监测来测量。同样，OFT不仅仅是运动活动的测量，而且涉及到其他因素，如探索驱动（好奇心）和恐惧（或焦虑）。大多数老鼠会倾向于在靠近墙壁的地方花费大部分时间，这种现象被称为触壁性。OFT最初开始作为一个新奇性测试，然后，如果测试持续足够长的时间，可以测量一般活动。在早期暴露期间，焦虑可能在一般活动和触壁性方面都起作用，后来更多的只在触壁性方面起作用。因此，虽然OFT越来越被用作测量一般运动活动的代理，但这是一个忽视了许多不同方面对OFT行为的贡献的趋势。

关于OFT在何种程度上是情绪性的可靠测量，已经有过讨论。一些结果，特别是排便、中心时间和前5分钟内的活动，可能测量了情绪性的某些方面。OFT中的早期活动可以测量焦虑，因为它可能引发分离压力（因为动物被从其笼伴隔离）和广场恐惧症（暴露于大型旷场与熟悉的标准鞋盒式保持笼完全不同）。典型的OFT的布局也与啮齿类动物在野外通常的生活方式形成对比：在社交网络、地下洞穴或保护区域中。此外，中心时间通常对γ-氨基丁酸（GABA）作用的抗焦虑药（在大多数情况下是苯二氮卓类药物）的急性给药敏感，但通常被认为对短期或长期的SSRIs治疗不敏感。然而，这可能取决于品系和剂量，许多现有的研究已经在大鼠中进行。作为与这一总体发现冲突的数据的一个例子，Dulawa等人已经显示，长期在饮用水中给予18和25 mg/kg/day的氟西汀，但不是10 mg/kg/day，导致BALB/cJ小鼠中心入口数的增加。然而，对单胺作用抗焦虑药的一般不敏感性，啮齿类动物的自然习性和倾向，以及其他证据，已经导致了中心时间可能测量“正常”焦虑并对严重的“病理性”焦虑不敏感的建议，如在一些人类疾病中所见。

在旷场内的小鼠运动可以使用许多不同的机制进行监测。历史上，第一种方法依赖于在旷场的表面标记出水平和垂直的平行线（或者在圆形旷场的情况下有时是同心的），形成一个网格。观察者（无论是现场的还是通过视频录制的）记录鼠从网格的一个方块跨越到另一个方块的次数，也记录是否进入中心或周边方块。第二种机制涉及使用红外传感器，通常也是放在两个方向上。传感器也可以放在第三个维度（高度）上，以监测抬起或头部下沉（如果旷场包括一个洞口地板）。最后一个常见的机制涉及使用视频摄像头和软件进行顶部跟踪（图1.2），可以从包括Noldus（Ethovision；荷兰）、上海欣软（VisuTrack，中国上海）和Stoelting Co（ANY-maze；，USA）在内的许多供应商那里获得。

图1.2   大小鼠旷场实验箱 型号XR-XZ301，上海欣软                       

2.设备、材料和设置 

2.1. 房间

隔离声音和无意的干扰。如果有环境噪音变化的担忧，可以使用白噪音机器（例如，白噪音发生器，San Diego Instruments，San Diego, CA, USA 或者声音疗法机器，Conair Corporation, Glendale, AZ, USA）。

旷场地的一致照明。如在“实验变量”中讨论的，不同的研究者使用的照明量差异很大，可以是红色或白色。作为经验法则，我们的实验室通常使用大约30勒克斯的暗光。更亮的光（尤其是更亮的白光）可能会增加触墙性和/或减少运动，但在明亮的环境中进行测试并不少见。无论选择何种光线级别，研究者都应使用光度计记录光线级别，并在任何出版物中报告此级别。

2.2. 旷场材料

任何材料，包括塑料、金属或木头，都可以用来构建旷场。塑料或耐腐蚀金属更可取，因为这些材料可以轻松清洁和消毒。大小可以大不相同（见实验变量）。使用的既有矩形也有圆形的旷场。矩形旷场的优点是可以更容易地将多个旷场放入一个测试房间。圆形旷场则消除了老鼠在角落里待的选项。对于简单的活动测量，大多数大小都会提供合理的数据。如果还在测量其他参数，特别是触墙性，那么更大的场地可能会提供更准确的数据（推荐至少40 * 40厘米的大小）。墙高应至少为35厘米。这个高度既限制了老鼠看到墙外的能力，也通常足够高，除非在极端情况下，可以防止老鼠跳出旷场。最常见的是在裸地上测试老鼠。然而，一些实验室在薄薄的床铺上进行测试。许多协议要求在老鼠之间彻底清洁，尽管其他程序在动物之间保持床铺。还有其他协议只移除粪便和尿液，因为轻微但一致的嗅觉线索比任何残留的消毒剂味道更可取。我们提供了一种在老鼠之间用消毒剂轻度清洁的协议；然而，无论选择何种方法，最重要的是在自己的实验室内外保持一致。如果使用顶部视频跟踪系统，考虑使用哑光地板以防止反射。

2.3. 获取数据的方法

如前所述，这可以手动完成，如果旷场地被划分为不同的区域（图2.1）。更常见的是在配备有光电池的旷场中进行测试，或者动物被计算机化跟踪软件监控。

2.4. 计时器 这可以由设备或数字跟踪软件自动化，也可以是单独的手持计时器。

2.5. 测试后的新鼠笼

通常，将老鼠放入新笼子比放回其笼伴侣那里更可取，因为重新引入老鼠可能会修改尚未测试的老鼠的行为。

2.6. 清理材料

通常包括一个垃圾桶和纸巾来清理尿液和擦拭旷场。一个小而安静的手持式吸尘器通常很适合清除紧凑的粪便。

2.7. 消毒剂 一个装有10-70%酒精的喷雾瓶可以用于一般擦拭。注意，酒精应谨慎使用，因为它可能会导致许多塑料裂纹，并溶解用于将塑料和其他材料粘合在一起的胶水。

3. 实验流程

任何类型的新奇或压力都可能改变探索行为。因此，减少新奇，例如笼子的变化，对于测试前的一段时间至关重要，通常至少24小时。同样重要的是，所有要在一组内进行比较的动物在其生命中都以相同的方式处理。应尽一切可能减少背景压力，并确保所有处理都是随机的。程序将在实验室之间变化，根据实验设计，老鼠可能只被测试一次或多次以评估对滥用药物的适应性或敏感性。历史上，OFT通常在5或10分钟内进行。这个时间段的一个原因是活动是手动评分的，一次一个动物。新的系统是自动化的，允许动物在任何一个时间点在多个旷场中单独测试。在我们的实验室，我们通常在60分钟的时间内进行OFT。这使我们能够评估初次接触期间的探索活动和通常在旷场的新奇消退后，通常是接触开始后的30分钟，看到的一般活动。

3.1 在测试前至少1小时将老鼠运送到测试室，让老鼠适应实验室环境。如果转移涉及到环境变化过大或其他可能的压力源，这个时间段应该延长。

3.2打开视频摄像机、光电检测设备或其他跟踪系统。注意，无论使用何种数据采集方法，最好的做法是使用视频摄像机记录每个会话。这样，如果有必要，可以在以后的时间重新评估会话的结果。

3.3清洁旷场地（OF）。即使在初始试验之前旷场地并不脏，清洁也很重要，这样所有的动物都能平等地体验到消毒剂的残留气味。

3.4将老鼠放入旷场地。最常见的是将老鼠放在中心。然而，有时也会将老鼠放在靠近墙壁的地方，这是因为这样不会立即将老鼠暴露在压力情境（旷场地的中心）中，或者因为这样可能更容易到达（在旷场地面积大的情况下）。

3.5启动计时器。

3.6测试者应该离开房间，或者尽可能远离旷场和老鼠的视线。在每次试验中，测试者应保持静止和安静。

3.7在试验结束时，将老鼠从旷场中移出，并放入新的笼子。

3.8计数粪便。如前所述，粪便的数量与动物的情绪或焦虑状态有关。粪便数量的增加与其他焦虑度量相关。

3.9用消毒剂清洁旷场地（如果使用了吸尘器的话）。

3.10在将下一只老鼠放入旷场地之前，等待消毒剂完全干燥。

系统的类型，以及在一定程度上旷场地的大小，将决定可以可靠测量的参数的类型和数量。对于手动跟踪，这通常包括穿过的方格数、在中心方格中花费的时间、后腿立起的次数和粪便。对于自动系统，可以测量的参数数量似乎无穷无尽。然而，通常最有用的结果是移动的距离（无论是真实距离测量还是相对单位）、移动的时间、在中心的时间、垂直活动和粪便。通常，计算这些输出在整个时间段（例如，总移动距离），并根据测量，也分为时间区间。例如，每5分钟移动的距离是呈现和分析数据的常见方法。实验的主要结果通常被视为连续变量，并根据比较的组数或实验条件的数量，使用t检验或方差分析（ANOVA）进行分析。分箱数据（例如，1小时内每5分钟移动的距离）应通过两因素ANOVA进行分析，时间为一个因素，处理（或基因型等）为另一个因素。

如果您也对动物实验感兴趣，欢迎关注和推荐关注微信公众号：欣软言行，也可以添加手机/微信：18121054991，专注于动物神经科学与行为学的实验知识的方法传播与分享交流，您可以推荐给您身边的朋友、同学以及老师，我们会定期更新您需要的相关实验方法的视频和文章，希望能对大家带来帮助。