类器官包埋及HE染色实验方法

我们辛辛苦苦养好的类器官，该如何做鉴定呢？通常是HE染色和免疫组化染色。今天小编带大家了解一下类器官如何进行包埋及HE染色。

 

一、类器官收集

1、类器官收集（例如24孔板，收集1-2孔类器官，大约200-500个类器官）；

2、4℃静置 10min，离心弃去大部分上清。

 

二、琼脂糖凹槽制备

 

1、称量0.2至0.4g琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内；

2、加入10mL左右PBS；

3、微波炉高火融化，每隔5s暂停打开，观察，重复数次至琼脂糖融化完全；

4、取约200uL融化琼脂糖，加入至600uL 1.5ml EP管内（如下图所示）；

5、在盛有琼脂糖的1.5ml EP管内插入一小0.5ml EP管，使琼脂糖形成一圆尖底凹槽，室温或者4℃冰箱静置数分钟，至琼脂糖凝固，轻轻转动小0.5ml EP管，取出0.5ml EP管，可看到琼脂糖内形成一个深圆尖底槽；

6、吸取类器官沉淀置于凹槽底部，尽量包埋在中间位置；

7、加入PBS至高于琼脂糖槽的边缘。

 

三、类器官固定

 

四、类器官包埋

 

1、脱水：取出已凝固的含有类器官沉淀的琼脂糖块，在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%和95%乙醇各1h，100%乙醇30min，待其凝固；

2、融蜡：提前4h左右打开烘箱，65℃溶蜡；

3、透明：将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中（二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中），将包埋盒转移至二甲苯中5min处理两次；注：因二甲苯有毒性，需在通风良好区域进行操作，取出时尽量沥尽残留二甲苯；

4、浸蜡：透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡2h后，更换新的蜡缸再次浸蜡2h；

5、包埋：包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块完全凝固后，小心脱下模具。

 

五、类器官HE染色

 

1、石蜡切片脱蜡至水

依次将切片放入二甲苯I 10min；二甲苯Ⅱ10min；无水乙醇Ⅰ5min；无水乙醇Ⅱ5min；95%酒精5min；90%酒精5min；80%酒精5min；70%酒精5min；蒸馏水洗。

 

2、苏木素染细胞核

切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗。

 

3、伊红染细胞质

切片入伊红染液中染色1-3min，自来水洗。

 

4、脱水封片

将切片依次放入95%酒精I 5min ；95%酒精II 5min；无水乙醇Ⅰ5min ；无水乙醇Ⅱ5min ；二甲苯Ⅰ5min ；二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

 

5、显微镜镜检，图像采集分析

 

六、类器官鉴定-HE染色结果（以肺癌为例）

人肺癌类器官HE染色