原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤
原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤
1、生长培养好的试验材料（一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片）
2、在拟南芥开花前取样（30片叶子左右即可）
3、切取叶片为0.5-1mm的细条（如果材料能达到每克107个原生质体，10-20片叶子需要5-10mL酶解液）
4、迅速将切下的样品转到酶解液中，要求完全浸没。
5、黑暗条件下抽真空30min。
6、连续酶解，室温下23℃黑暗中静止酶解3h
7、利用光学显微镜检查原生质体（30-50μm大小）
8、在过滤前加入等量的W5溶液
9、洗干净滤网，并用W5润湿，之后过滤
10、离心100g，1-2min沉淀原生质体，尽可能吸走上清，重复洗2次
11、重悬原生质体于W5中，保持在2*105个/ml，冰浴30min。
12、100g离心2min，尽可能吸走上清，利用MMG重悬，浓度约2*105个/ml
13、加入10μL质粒（1000ng-2000ng）于2ml离心管中
14、加入100μL原生质体（2*104个），轻轻混匀。
15、加110μL PEG solution，轻弹使充分混匀
16、23℃室温孵育30min。
17、加400-440μL W5混匀，终止反应
18、100g，2min 23℃离心，去上清，重复洗一次
19、用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养
20、20-25℃孵育16h以上
21、取样制片观察
溶液配制：
1、酶解液的配制（20ml）试剂终浓度质量/g
W5溶液配制（500mL）
MMG配制（100mL）
PEG配制（10mL）
1、生长培养好的试验材料（一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片）
2、在拟南芥开花前取样（30片叶子左右即可）
3、切取叶片为0.5-1mm的细条（如果材料能达到每克107个原生质体，10-20片叶子需要5-10mL酶解液）
4、迅速将切下的样品转到酶解液中，要求完全浸没。
5、黑暗条件下抽真空30min。
6、连续酶解，室温下23℃黑暗中静止酶解3h
7、利用光学显微镜检查原生质体（30-50μm大小）
8、在过滤前加入等量的W5溶液
9、洗干净滤网，并用W5润湿，之后过滤
10、离心100g，1-2min沉淀原生质体，尽可能吸走上清，重复洗2次
11、重悬原生质体于W5中，保持在2*105个/ml，冰浴30min。
12、100g离心2min，尽可能吸走上清，利用MMG重悬，浓度约2*105个/ml
13、加入10μL质粒（1000ng-2000ng）于2ml离心管中
14、加入100μL原生质体（2*104个），轻轻混匀。
15、加110μL PEG solution，轻弹使充分混匀
16、23℃室温孵育30min。
17、加400-440μL W5混匀，终止反应
18、100g，2min 23℃离心，去上清，重复洗一次
19、用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养
20、20-25℃孵育16h以上
21、取样制片观察
溶液配制：
1、酶解液的配制（20ml）试剂终浓度质量/g
| 试剂 | 终浓度 | 质量/g | |
| MES | 20mM | 0.08528 | KOH调pH5.7 |
| D-Mannitol | 0.4M | 1.45736 | |
| KCl | 20mM | 0.02982 | |
| macerozyme R-10 | 0.40% | 0.08 | |
| Cellulase R-10 | 1.50% | 0.3 | |
| 55℃水浴10min，待冷却后再加以下试剂 | |||
| CaCl2·2H2O | 10mM | 0.029402 | |
| BSA | 0.10% | 0.02 | |
| 试剂 | 终浓度 | 质量/g | |
| MES | 2mM | 0.19524 | KOH调pH5.7 |
| NaCl | 154mM | 4.49988 | |
| CaCl2·2H2O | 125mM | 9.18825 | |
| KCl | 5mM | 0.186375 |
| 试剂 | 终浓度 | 质量/g | |
| MES | 4mM | 0.078096 | KOH调pH5.7 |
| D-Mannitol | 0.4M | 7.2868 | |
| MgCl2·6H2O | 15mM | 0.30495 |
| 试剂 | 终浓度 | 质量/g |
| PEG 4000 | 40% | 4 |
| D-Mannitol | 0.2M | 0.36434 |
| CaCl2·2H2O | 100mM | 0.14701 |
