细胞被支原体污染后的特征及支原体检测试剂盒使用方法

很多小伙伴都疑惑，细胞被支原体污染后的特征是什么？如何鉴别细胞被支原体污染了？今天，我带大家分享两个支原体污染的案例，共同探寻一下细胞被支原体污染后的特征。
 

图1 感染支原体的EBTr（牛胚气管细胞）

先来观察一下被支原体污染的牛胚气管细胞（图1），由成纤维样逐渐变得类上皮样；质膜铺展，溃烂；轮廓不清，边界模糊。再看右图，细胞处于边增殖边凋亡的状态，漂浮凋亡细胞过多。

图2 感染支原体的HT1080（人纤维肉瘤细胞）

接下来再观察一下被支原体污染的人纤维肉瘤细胞HT1080（图2），由上皮样逐渐变得类成纤维样，胞体细长，和前面的牛胚气管细胞形态变化刚好相反；伪足伸长，出现明显的拉丝现象，表明细胞可能在“痛苦”地迁移。使用了支原体杀除试剂，彻底根除了支原体以后，如右图所示，细胞逐渐恢复了上皮样形态，拉丝减少。

图3 细胞膜上的支原体集落

接下来，给大家展示贴附在细胞膜上的支原体集落（图3），支原体是目前已知最小的原核生物，直径大小在0.1-0.3um，比细菌还要小。支原体可在培养液、细胞膜、细胞内增殖。单个支原体需要借助于电镜才可以观察到具体形态，图中膜上的黑点为支原体集落。细胞背景干净，形态没有大的变化，但质膜粗糙，布满黑点。
 

总结下来，细胞被支原体污染的主要特征如下：

✔ 增殖减慢；

✔ 上清液澄澈；

✔ 背景干净；

✔ 细胞形态异常（拉丝、铺展）；

✔ 更换新的培养液细胞状态没有恢复。

细胞被支原体污染后的共性表现为细胞增殖减慢、上清液澄澈、背景干净，这3点可以明确地排除真、细菌污染。值得一提的是，当给细胞的营养体系不佳时，细胞也会表现出形态异常，所以，我们可以给细胞更换新的培养液，如果细胞也没有恢复正常形态，此时判断细胞极有可能被支原体“附身”了。
 

上述的判断方法需要丰富的经验积累，日常细胞培养中，我们还可以用PCR扩增试剂盒检测细胞是否有支原体污染。
 

支原体检测试剂盒（PCR法）使用方法
 

1、样品准备

取适量待检细胞培养上清于洁净的PCR管中（如果是血清样本，可用 Mycoplasma Free Water 稀释），利用PCR仪95℃热处理5min后作为模板；
 

2、PCR体系配制

每次实验需设置阴性对照（将1μL待检样品换成等量的Mycoplasma Free Water）与阳性对照（在1μL待检样品中加入0.5μL Positive Control后一起作为Template），实验时戴一次性口罩与手套，谨慎操作，防止操作不当引入外源支原体污染；
 

3、PCR程序设置

表2

4、凝胶电泳

取10μL PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测；
 

5、结果分析

每次实验通过与阴性对照、阳性对照检测结果比较确认样品支原体污染情况，阳性条带大小500bp左右。如阴性对照检测结果中有条带很有可能是PCR体系中出现污染，建议重新实验确认结果。如有必要，也可对PCR产物进行常规测序，以确定具体的支原体种属。