高通量单B细胞筛选技术及解决方案
抗体（antibody）是指机体因抗原刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。其中利用分子生物学技术生产，用于疾病或病毒感染治疗的抗体，被称为抗体药物。抗体药物，具有直击肿瘤特异性抗原、高特异性、低不良反应和疗效确切等特点，在肿瘤、自身免疫、代谢、病毒感染等疾病领域显示出独特的优势和广阔的应用前景，是目前最大的治疗用生物剂类别。
单克隆抗体作为抗体药物的先行者，在全世界十大用药里面有 7 个是单抗药，已经在多个治疗领域展现出其独特的治疗价值。抗体药物在研发周期上跟小分子药物相比也有所缩短，市场需求亦逐年扩容，逐渐成为生物医药领域的重要发展方向。并且随着现代生物技术发展及对抗体结构和功能不断深入认识，研究人员通过不同抗体片段的组合、对抗体表面的位点进行修饰、偶联小分子药物或其他化学物质等策略，发展了数量庞大的抗体结构形式，并各有优势。包括抗体融合蛋白 、抗体偶联药物（ADC）、双特异性抗体（BsAb）、小分子抗体片段等。从目前的研发流程来看，这些其他类别的抗体药物也是从单克隆抗体发现开始。另外在细胞治疗领域，细胞治疗相关的 CAR-T 和 CAR-NK 的 CAR 候选分子开发需要对单克隆抗体与抗原结合的亲和力进行筛选，研发起点同样始于单克隆抗体发现。以上生物治疗相关的产品开发，从研发流程来看，都起始于单克隆抗体发现。可见单克隆抗体市场需求容量庞大，因此单克隆抗体筛选技术的迭代亦备受瞩目，发展也是日新月异。
单克隆抗体发现
目前，单克隆抗体发现的技术主要有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单 B 细胞筛选技术。其中单 B 细胞筛选技术因为其研发周期短而备受瞩目。
杂交瘤技术：可筛选出无限增殖并分泌抗体的杂交融合细胞，用于稳定生产具有天然活性的单克隆抗体。但通常制备需 5-6 个月，且得到的抗体免疫原性高、半衰期短、批间差异大，其次融合效率低，易丢失抗体的多样性，不利于新抗体的发现。
噬菌体展示技术：将抗体 DNA 序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因适当位置，抗体随噬菌体组装展示于噬菌体表面。该技术无需 B 细胞培养过程，但是抗体未经过体内成熟过程，抗体序列往往亲和力有限，特异性差，重链和轻链的随机组合，使得抗体重链轻链无法保持天然配对。
噬菌体展示技术
单 B 细胞筛选技术：是近年来新兴的单抗发现技术，其将单细胞分离鉴定技术与分子生物学技术结合，获得单个 B 细胞抗体基因并进行体外克隆和表达，获得的抗体保证了轻重链可变区的天然配对，相较于传统的抗体制备技术，具有效率高、全人源、基因多样性丰富、细胞数量少、周期短、适用于任意动物抗体筛选等优点。因可直接获得抗体基因序列，方便下游抗体工程改造，在抗体药物研发、快速应对病原微生物传染病方面具有巨大优势，是免疫诊断试剂和治疗药物开发的理想选择。
单 B 细胞筛选技术
单克隆抗体发现技术方法总结对比
单 B 细胞筛选技术
基于单 B 细胞筛选技术有诸多优势但存在抗原特异性细胞比例低的特点，需要借助高通量及高灵敏的分选系统对少量的特异性 B 细胞进行富集，目前用于单 B 细胞抗体筛选技术主要有液滴微流控技术、微孔/微腔室技术和流式细胞分选技术。 
液滴微流控是近年来微流控领域的一个重要发展分支，该技术将每一个微液滴视为一个独立的反应器，以实现大规模的反应检测与筛选。基于液滴微流控的分选技术，具有通量高、成本低、操作简单等优势，在单 B 抗体发现领域具有巨大潜力。而目前，成熟商业化的仪器平台仍然较少，存在较大的未被满足的需求。
基于微孔/微腔室技术的单 B 细胞分选，其先将细胞导入微孔小室，之后再导入检测试剂，基于荧光信号分选阳性细胞，可通过抗原特异性检测，分选出分泌型功能浆 B 细胞，单张芯片可实现 1-2w 个细胞评估分选，解决了单细胞分离和单细胞筛选问题，但筛选通量有限，且商业化的仪器成本和单次运行成本都非常昂贵，引入门槛过高，整体市场占有率较低。
而流式细胞技术，基于细胞表面或胞内标志物对细胞进行分选，无法基于细胞分泌的蛋白进行分选，因此只适合于记忆型 B 细胞的分选，无法直接对分泌抗体的浆细胞进行功能性检测，存在后期工作量大、成本高、灵敏度低、假阳性率高等局限性。
液滴微流控是近年来微流控领域的一个重要发展分支，该技术将每一个微液滴视为一个独立的反应器，可实现大规模的反应检测与筛选。基于液滴微流控的分选技术，单次实验可以处理 106 个浆 B 细胞，且使用的耗材设计简单、生产产业链成熟。整体来说，具有通量高、成本低、操作简单等优势。在单 B 抗体发现领域具有巨大潜力。但目前，成熟商业化的仪器平台仍然较少，市场潜力有待铺垫。
Comet 彗星高通量单细胞筛选系统以微液滴作为单 B 细胞检测的反应单元，实现功能性单 B 细胞的高通量筛选。
1）实验设计与方法选择：选择合适的方法学：磁珠法检测或 FRET 法检测。
2）细胞包裹：使用液滴生成系统将功能性荧光检测试剂与 B 细胞包裹成微液滴。
3）液滴孵育和抗体分泌：这个过程中，微液滴中单个 B 细胞能够产生和分泌一定量的单克隆抗体，抗体与液滴中 B 细胞功能检测试剂反应并产生荧光信号。
4）目标B细胞筛选：使用彗星高通量筛选系统，检测液滴中反应后的荧光信号，对阳性液滴细胞进行高通量分选富集。单次可实现百万级别单 B 细胞的筛选。
5）BCR测序：筛选后的阳性 B 细胞可进行低通量的 RT-PCR 后接测序从而获取 BCR 序列。亦可直接在达普自主开发的 Galaxy 单细胞建库系统进行高通量单细胞文库构建。
6）目标 VH - VL 序列获取：高通量测序后，获得单 B 细胞的 BCR 序列，通过自主开发的 StarScope 生信分析软分析拼接，最终获得轻重链配对的抗体序列，用于后期载体构建及表达。
单克隆抗体作为抗体药物的先行者，在全世界十大用药里面有 7 个是单抗药，已经在多个治疗领域展现出其独特的治疗价值。抗体药物在研发周期上跟小分子药物相比也有所缩短，市场需求亦逐年扩容，逐渐成为生物医药领域的重要发展方向。并且随着现代生物技术发展及对抗体结构和功能不断深入认识，研究人员通过不同抗体片段的组合、对抗体表面的位点进行修饰、偶联小分子药物或其他化学物质等策略，发展了数量庞大的抗体结构形式，并各有优势。包括抗体融合蛋白 、抗体偶联药物（ADC）、双特异性抗体（BsAb）、小分子抗体片段等。从目前的研发流程来看，这些其他类别的抗体药物也是从单克隆抗体发现开始。另外在细胞治疗领域，细胞治疗相关的 CAR-T 和 CAR-NK 的 CAR 候选分子开发需要对单克隆抗体与抗原结合的亲和力进行筛选，研发起点同样始于单克隆抗体发现。以上生物治疗相关的产品开发，从研发流程来看，都起始于单克隆抗体发现。可见单克隆抗体市场需求容量庞大，因此单克隆抗体筛选技术的迭代亦备受瞩目，发展也是日新月异。
单克隆抗体发现
目前，单克隆抗体发现的技术主要有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单 B 细胞筛选技术。其中单 B 细胞筛选技术因为其研发周期短而备受瞩目。
杂交瘤技术
噬菌体展示技术：将抗体 DNA 序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因适当位置，抗体随噬菌体组装展示于噬菌体表面。该技术无需 B 细胞培养过程，但是抗体未经过体内成熟过程，抗体序列往往亲和力有限，特异性差，重链和轻链的随机组合，使得抗体重链轻链无法保持天然配对。
噬菌体展示技术
单 B 细胞筛选技术：是近年来新兴的单抗发现技术，其将单细胞分离鉴定技术与分子生物学技术结合，获得单个 B 细胞抗体基因并进行体外克隆和表达，获得的抗体保证了轻重链可变区的天然配对，相较于传统的抗体制备技术，具有效率高、全人源、基因多样性丰富、细胞数量少、周期短、适用于任意动物抗体筛选等优点。因可直接获得抗体基因序列，方便下游抗体工程改造，在抗体药物研发、快速应对病原微生物传染病方面具有巨大优势，是免疫诊断试剂和治疗药物开发的理想选择。
单 B 细胞筛选技术单克隆抗体发现技术方法总结对比
单 B 细胞筛选技术
基于单 B 细胞筛选技术有诸多优势但存在抗原特异性细胞比例低的特点，需要借助高通量及高灵敏的分选系统对少量的特异性 B 细胞进行富集，目前用于单 B 细胞抗体筛选技术主要有液滴微流控技术、微孔/微腔室技术和流式细胞分选技术。
基于微孔/微腔室技术的单 B 细胞分选，其先将细胞导入微孔小室，之后再导入检测试剂，基于荧光信号分选阳性细胞，可通过抗原特异性检测，分选出分泌型功能浆 B 细胞，单张芯片可实现 1-2w 个细胞评估分选，解决了单细胞分离和单细胞筛选问题，但筛选通量有限，且商业化的仪器成本和单次运行成本都非常昂贵，引入门槛过高，整体市场占有率较低。
而流式细胞技术，基于细胞表面或胞内标志物对细胞进行分选，无法基于细胞分泌的蛋白进行分选，因此只适合于记忆型 B 细胞的分选，无法直接对分泌抗体的浆细胞进行功能性检测，存在后期工作量大、成本高、灵敏度低、假阳性率高等局限性。
液滴微流控是近年来微流控领域的一个重要发展分支，该技术将每一个微液滴视为一个独立的反应器，可实现大规模的反应检测与筛选。基于液滴微流控的分选技术，单次实验可以处理 106 个浆 B 细胞，且使用的耗材设计简单、生产产业链成熟。整体来说，具有通量高、成本低、操作简单等优势。在单 B 抗体发现领域具有巨大潜力。但目前，成熟商业化的仪器平台仍然较少，市场潜力有待铺垫。
Comet 彗星高通量单细胞筛选系统以微液滴作为单 B 细胞检测的反应单元，实现功能性单 B 细胞的高通量筛选。
1）实验设计与方法选择：选择合适的方法学：磁珠法检测或 FRET 法检测。
2）细胞包裹：使用液滴生成系统将功能性荧光检测试剂与 B 细胞包裹成微液滴。
3）液滴孵育和抗体分泌：这个过程中，微液滴中单个 B 细胞能够产生和分泌一定量的单克隆抗体，抗体与液滴中 B 细胞功能检测试剂反应并产生荧光信号。
4）目标B细胞筛选：使用彗星高通量筛选系统，检测液滴中反应后的荧光信号，对阳性液滴细胞进行高通量分选富集。单次可实现百万级别单 B 细胞的筛选。
5）BCR测序：筛选后的阳性 B 细胞可进行低通量的 RT-PCR 后接测序从而获取 BCR 序列。亦可直接在达普自主开发的 Galaxy 单细胞建库系统进行高通量单细胞文库构建。
6）目标 VH - VL 序列获取：高通量测序后，获得单 B 细胞的 BCR 序列，通过自主开发的 StarScope 生信分析软分析拼接，最终获得轻重链配对的抗体序列，用于后期载体构建及表达。
