脑微透析术在成年大鼠褪黑素含量脑透析液和血清中测定的应用

褪黑素（melatonin，MLT）主要是由松果体分泌的一种吲哚类激素,具有明显的昼夜节律性,分泌高峰在夜间,白天分泌减少,且合成与分泌受光/暗周期信号、神经系统等因素的调节。本研究以正常成年大鼠为研究对象，将引导管置入前脑纹状体内，采用脑微透析技术动态收集透析液样本，并采集大鼠尾静脉血；用高效液相色谱‐荧光法测定大鼠体内的MLT，并分析脑透析液与血清中MLT之间的相关性；同时用酶联免疫法测定血清中MLT含量，比较2种检测方法的一致性，为进一步了解体内MLT的分泌模式、MLT含量的测定提供一种更为合理、有效的方法 。

脑微透析术及透析液样本的收集

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），固定于脑立体定位仪上。根据大鼠脑立体定位图谱，将微透析引导管置入右侧纹状体（ AP：+1.0mm， MR：+2.5mm，DV：-4.0mm），并用小螺丝和牙科水泥固定 ，静养1周后进行脑微透析术。在收集脑透析液过程中每只大鼠均单独进行，将大鼠放入清醒动物的自由活动装置中，拔出引导针，插入微透析探针，用Ringers液(140 mmol/L NaCl ,4 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl₂，1 mmol/L MgCl₂ ,pH=7.4)平衡灌流1 h后,以2 μL/min 收集10 :00,14 :00,18 :00 ,22 :00,2 :.00和6 :00各时间点下大鼠安静、清醒状态下的透析液样本，每个时间点收集3管，每管收集10min，样本收集好后行色谱荧光法测定MLT含量，并取3管的平均值作为该时间点的MLT水平。在晚上收集样本时注意避免白光，以免干扰MLT的昼夜节律。探针每次使用前先做探针体外回收率的测定，用以折算透析液样本中MLT的浓度，并在透析后再次测定探针回收率，分析探针透析效能的变化。

血样的采集及处理

于脑透析术后次日22:00 ,采集大鼠尾静脉血液标本1mL,4C静置过夜,1000g离心20min,取上清。取50μL血清直接用ELISA法测定MLT含量，余下血清用三氯甲烷反复萃取,将三氯甲烷层真空干燥、氮气吹干、最后残留物用流动相溶解进样,行色谱荧光法检测MLT含量,并计算血清中MLT的提取回收率。

结果

1.MLT检测方法的建立

与ELISA法相比，HPLC‐荧光法具有较低的检出限值、呈较好的线性关系，日内、日间精密度<6%，重现性较好，具有灵敏、快速、准确的特点。（表1）

表 1  ２种褪黑素检测方法的比较

2.大鼠脑透析液及血清中的MLT含量测定

(1)用色谱法测定探针透析前、后对MLT的回收率分别为(13.10士1.13 )%和(12.33士1.02)% ,两者差别无统计学意义(n=6,P=0.508) ,提示探针对MLT透析效能比较稳定。

(2)用荧光检测器测定22 :00脑透析液及血清样本中MLT ,色谱检测结果（图1）,MLT的分离效果良好,出峰时间在10min左右,22:.00血清中的MLT峰面积明显高于脑透析液(n=8,P<0.001)。

图1 HPLC检测正常大鼠纹状体透析液和血清中22：00的褪黑素水平

(3) HPLC - 荧光法测定2 : 00,6 : 00,10 : 00,14 : 00,18 : 00和22 : 00各时间点大鼠纹状体脑透析液中的MLT含量分别为(32.99士2.22 ), (18.25土2.27 ),(4.03土1.70),(2.92士1.08 ),(12.08土1.77 )和(21.83土2 .04 )pg/mL,具有明显的昼夜节律(图2)。

 

图2 纹状体透析液褪黑素水平在2:00,6:00,10:00,14:00,18:00和22:00的波动情况

(4 ) HPLC - 荧光法测定22 : 00血清中的MLT含量为(82.62士8.09 )pg /mL ,提取回收率>90%,血清与透析液中的MLT含量具有高度正相关(r=0.987,P<0.001 )(图3);ELISA测定血清中的MLT含量为(81.31士9 .62 )pg/mL,用2种方法测定血清中的MLT含量差别无统计学意义(P=0.115)。

图3 脑透析液和血清中褪黑素水平的相关性

本研究结果表明，用改良的HPLC‐荧光检测法测定大鼠脑透析液以及血清中的MLT含量简单、快速、灵敏、准确、重复性好、成本低，血清中MLT和脑内MLT具有很好的相关性，且 HPLC‐荧光法和ELISA法测定血清MLT具有较好的一致性，为探究体内MLT分泌模式、测定MLT含量提供一种有效的方法 。 

文章来源:福建医科大学学报：成年大鼠脑透析液和血清中褪黑素含量的测定，孟 涛１ ，２ ，郑志竑１ ，叶 婧１ ，林 玲１

 

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