小鼠II型肺泡上皮细胞的分离及流式分选方法
在过去的几年里，肺泡II型上皮细胞(AECII)在肺免疫调节的各个方面的贡献越来越被认识。AECII已被证明参与炎症气道中细胞因子的产生，甚至在感染和T细胞介导的自身免疫中作为抗原提呈细胞。
图1.肺泡上皮由两种不同的细胞类型组成，肺泡I型和II型细胞
许多关于AEC II功能的研究是使用小鼠或人肺泡上皮细胞系进行的。使用细胞系当然提供了一系列的好处，例如可获得大量的细胞进行广泛的分析。然而，使用原代小鼠AECII可以更好地研究其在感染或自身免疫炎症等复杂过程中的作用。原代小鼠AECII可以直接从患有这种呼吸条件的动物中分离出来，这意味着它们已经受到了在分析环境中发挥作用的所有额外外部因素的影响。例如，可以从感染甲型流感病毒的小鼠鼻内分离出AECII，甲型流感病毒主要以这些细胞为目标进行复制。重要的是，通过从健康小鼠分离的AECII进行体外感染实验，可以进一步深入对感染后细胞反应的研究。
该原代小鼠AECII分离方案是基于小鼠肺的酶解，然后用CD11c、CD11b、F4/80、CD19、CD45和CD16/CD32特异性抗体标记细胞，通过流式细胞仪进行细胞分选，AECII确定为未标记和SSC high细胞群。
肺细胞的分离方法
（1）CO2 处死小鼠。注意:不要脱颈处死小鼠，否则会损伤气管，后续再进行肺泡灌洗则不能成功；确保痛觉反射的丧失。向小鼠喷上适量乙醇，沿腹中线开腹并小心取出腹膜。
（2）割开小鼠的左右颈静脉和肾动脉放血，清除组织流动的血液；小心穿刺取出横膈膜，切掉肋骨，露出心脏和肺。要特别小心，不要损伤肺。
（3）用26G针头和10ml注射器经右心室灌注10ml冷的PBS至肺变白无血。肺部会变白。减少红血球的数量对于最终ATII细胞的产量和纯度是重要的。
（4）切掉唾液腺，露出气管。在气管处通过22G留置针固定导管。（如果需要，在下一步之前，可以通过插入气管的导管用PBS或培养基冲洗肺部，制备支气管肺泡灌洗液样本。）
（5）使用2ml注射器，将2ml的预先恢复至37℃的dispase酶通过导管注入肺，使所有肺叶充分扩张。将注射器更换为1毫升的注射器，其中含有0.5ml的液化琼脂糖，也注入肺中。将注射器留在导管上，防止琼脂糖回流，立即用实验室纸巾和冰块覆盖肺部，冷却几分钟。
（6）移除纸巾、冰块、注射器和导管，切除肺、心脏和胸腺。用PBS冲洗肺，取出心脏、胸腺和剩余的气管。将肺放入2ml dispase酶中，室温孵育45分钟。
（7）将肺从dispase酶中取出，转移到7ml含有抗CD16 /32抗体(1 μg/ml)和100 μl DNase的DMEM培养基中。用镊子将肺组织剪碎，室温200 rpm孵育10分钟。如果需要，细胞悬液可以在4°C保存，直到下一步。
（8）先用100 μm的细胞筛网过滤细胞悬液，再用70 μm、48 μm和30 μm的筛网进行过滤。将滤液收集到试管中，160 x g 、4°C离心15 min，弃上清液。
（9）将细胞重悬于2ml红细胞溶解缓冲液中(0.15 M NH4Cl, 0.01 M KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2)，并加入13 ml DMEM培养基快速终止溶解。160 x g、4°C离心12min，弃上清即获得肺泡上皮细胞。
流式分选II型肺泡上皮细胞
图2.通过阴性选择流式细胞术分离小鼠AECII的门控策略
当从健康小鼠的肺细胞悬液分选AECII门通常会占所有事件的42±10%。当使用患有呼吸道疾病(如病毒感染)的小鼠时，这一比例会明显降低，因为最初的细胞悬浮液将包含相当高比例的淋巴细胞和其他招募到呼吸道的免疫细胞。（A）表示细胞分选的逻辑概述；（B）肺细胞悬液的典型图；（C）分选后细胞的纯度。关于分选AECII的存活率，发现流式分选后的细胞存活率约为90%。这种高比例的活细胞可以直接进行功能分析，也可以对分离的原代小鼠AECII进行短期培养。
图1.肺泡上皮由两种不同的细胞类型组成，肺泡I型和II型细胞
许多关于AEC II功能的研究是使用小鼠或人肺泡上皮细胞系进行的。使用细胞系当然提供了一系列的好处，例如可获得大量的细胞进行广泛的分析。然而，使用原代小鼠AECII可以更好地研究其在感染或自身免疫炎症等复杂过程中的作用。原代小鼠AECII可以直接从患有这种呼吸条件的动物中分离出来，这意味着它们已经受到了在分析环境中发挥作用的所有额外外部因素的影响。例如，可以从感染甲型流感病毒的小鼠鼻内分离出AECII，甲型流感病毒主要以这些细胞为目标进行复制。重要的是，通过从健康小鼠分离的AECII进行体外感染实验，可以进一步深入对感染后细胞反应的研究。
该原代小鼠AECII分离方案是基于小鼠肺的酶解，然后用CD11c、CD11b、F4/80、CD19、CD45和CD16/CD32特异性抗体标记细胞，通过流式细胞仪进行细胞分选，AECII确定为未标记和SSC high细胞群。
肺细胞的分离方法
（1）CO2 处死小鼠。注意:不要脱颈处死小鼠，否则会损伤气管，后续再进行肺泡灌洗则不能成功；确保痛觉反射的丧失。向小鼠喷上适量乙醇，沿腹中线开腹并小心取出腹膜。
（2）割开小鼠的左右颈静脉和肾动脉放血，清除组织流动的血液；小心穿刺取出横膈膜，切掉肋骨，露出心脏和肺。要特别小心，不要损伤肺。
（3）用26G针头和10ml注射器经右心室灌注10ml冷的PBS至肺变白无血。肺部会变白。减少红血球的数量对于最终ATII细胞的产量和纯度是重要的。
（4）切掉唾液腺，露出气管。在气管处通过22G留置针固定导管。（如果需要，在下一步之前，可以通过插入气管的导管用PBS或培养基冲洗肺部，制备支气管肺泡灌洗液样本。）
（5）使用2ml注射器，将2ml的预先恢复至37℃的dispase酶通过导管注入肺，使所有肺叶充分扩张。将注射器更换为1毫升的注射器，其中含有0.5ml的液化琼脂糖，也注入肺中。将注射器留在导管上，防止琼脂糖回流，立即用实验室纸巾和冰块覆盖肺部，冷却几分钟。
（6）移除纸巾、冰块、注射器和导管，切除肺、心脏和胸腺。用PBS冲洗肺，取出心脏、胸腺和剩余的气管。将肺放入2ml dispase酶中，室温孵育45分钟。
（7）将肺从dispase酶中取出，转移到7ml含有抗CD16 /32抗体(1 μg/ml)和100 μl DNase的DMEM培养基中。用镊子将肺组织剪碎，室温200 rpm孵育10分钟。如果需要，细胞悬液可以在4°C保存，直到下一步。
（8）先用100 μm的细胞筛网过滤细胞悬液，再用70 μm、48 μm和30 μm的筛网进行过滤。将滤液收集到试管中，160 x g 、4°C离心15 min，弃上清液。
（9）将细胞重悬于2ml红细胞溶解缓冲液中(0.15 M NH4Cl, 0.01 M KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2)，并加入13 ml DMEM培养基快速终止溶解。160 x g、4°C离心12min，弃上清即获得肺泡上皮细胞。
流式分选II型肺泡上皮细胞
图2.通过阴性选择流式细胞术分离小鼠AECII的门控策略
当从健康小鼠的肺细胞悬液分选AECII门通常会占所有事件的42±10%。当使用患有呼吸道疾病(如病毒感染)的小鼠时，这一比例会明显降低，因为最初的细胞悬浮液将包含相当高比例的淋巴细胞和其他招募到呼吸道的免疫细胞。（A）表示细胞分选的逻辑概述；（B）肺细胞悬液的典型图；（C）分选后细胞的纯度。关于分选AECII的存活率，发现流式分选后的细胞存活率约为90%。这种高比例的活细胞可以直接进行功能分析，也可以对分离的原代小鼠AECII进行短期培养。
