悬浮培养HEK293细胞包装病毒载体的过程优化
基因转移的有效性和安全性决定了基因治疗的有效性。为了保护细胞外环境中的遗传物质免于降解，必须使用用于基因传递的载体系统。其被定义为用于将基因递送至靶细胞及其核中的载体。
一种被广泛使用的载体类型就是病毒载体，其已经进化为递送DNA（如腺相关病毒AAV）或RNA（如慢病毒LV）以复制到宿主细胞中。这些病毒载体都具有各自的优势，可采用贴壁培养、微载体悬浮培养（详见“应用微载体包装AAV病毒载体”）以及无血清悬浮培养等方式。无论如何，规模化生产病毒载体的可靠工艺，都是其临床转化的重要挑战。本文以需要采用转染方式包装病毒载体的LV和AAV为例，概述其悬浮培养HEK293细胞包装病毒载体的过程优化。
在此之前，先看一下各个病毒载体的特点以及外源基因进入细胞的方式。
各个病毒载体的特点
表1 不同病毒载体的特点
外源基因进入细胞的方式
常见转染方法:
· 化学转染：PEI、脂质体（昂贵）
· 物理转染：电穿孔、基因注射、显微注射（需要设备）
· 病毒：腺病毒、逆转录病毒
对于LV及AAV的转染过程，工业生产一般使用基于PEI的转染方法。细胞表面和DNA都带负电荷，PEI等转染试剂表面带正电荷，使用PEI包裹带负电荷的DNA，然后穿过带负电荷的细胞膜，进行病毒载体的包装。
图1 外源基因进入细胞的方式
Case1: 悬浮培养HEK293细胞包装LV过程优化
LV是出芽方式分泌，包装后的LV一般用于感染免疫细胞，使其表达出Car-T细胞Car的部分。
1、实验方法
1) 细胞株：HEK293SF-3F6
2) 反应器：一次性搅拌式反应器
3) 截留装置：0.8-0.45 µm
4) 培养方式：采用灌流培养的方式实现细胞密度的提高
2、实验结果：
2.1 转染时细胞密度对病毒滴度的影响
1) 转染时细胞密度：
LCD：1×106 cells/ml
HCD：5×106cells/ml
2) 采用灌流培养的方式实现细胞密度的提高，在使用LC-SFM培养基情况下，每天一个灌体积的灌流速率，可使细胞密度达到1×107 cells/ml，不仅增加了细胞密度，也移除了代谢副产物如乳酸、氨等。
3) 不管在LCD还是在HCD条件下转染，单个细胞产毒效率都在2 TU/cell左右。
4) 在LCD条件下，转染后3天病毒滴度达到峰值，约1×106 TU/ml，在HCD条件下，病毒滴度峰值可达5×106 TU/ml，转染时较高的细胞密度可以得到更高的病毒滴度。
病毒梯度，LCD（open bars），HCD（solid bars）。（B）细胞密度。总细胞计数（squares），活细胞计数（triangles），HCD（solid symbols），LCD（open symbols）
2.2 培养基对病毒滴度的影响
1) 优化培养基包括某品牌LC-SFM L; LC-SFM GL以及HyClone培养基SFMTransfx-293，代号HyQ。
2) 在使用LC-SFM L和 LC-SFM GL时，不论LCD还是HCD条件下，单个细胞产毒效率均为2 TU/ml。
3) 在使用HyQ (SFMTransfx-293)时，LCD转染条件下有很高的单个细胞产毒效率为6 TU/ml，但是HCD条件下，单个细胞转染效率减少为2 TU/ml，主要是因为HCD条件下，细胞结团严重，并在容器液面边缘形成一圈死细胞。造成这个现象的原因是PEI有一定毒副作用，为了降低PEI的使用量，降低原来1 µg DNA/106cells的使用量，选择0.4-0.6 µg DNA/106cells的使用量，转染后3天得到最高病毒滴度，为9×106TU/ml。
图3 不同类型培养基对LV生产的影响
转染阶段：HCD条件下使用LC-SFM L培养基 （solid grey bars）， HCD条件下使用LC-SFM GL培养基 （solid black bars），LCD条件下使用SFMTransfx-293培养基（open bars），HCD条件下使用SFMTransfx-293培养基（hatched bars）
2.3 转染后添加剂丁酸钠的浓度对病毒滴度的影响
1) 使用HyQ (SFMTransfx-293)培养基，在HCD转染条件下，转染后16h添加丁酸钠，优化其添加浓度，丁酸钠优化浓度范围为0.1-5 mM。
2) 转染后丁酸钠添加量大于2 mM时，会降低细胞密度；随着丁酸钠含量的增加，病毒滴度增加。在5 mM丁酸钠添加量条件下，转染后2天可达最大病毒滴度，为1×108 TU/ml。
图4 丁酸钠不同添加浓度对LV生产的影响，所有实验组均在SFMTransfx-293培养基中进行，在HCD条件下，使用0.4 µg DNA/106cells，丁酸钠使用量列于图中。
2.4 悬浮培养HEK293细胞包装LV过程优化汇总
1) 转染时，较高的细胞密度有利于提高病毒滴度；
2) HyClone培养基SFMTransfx-293能够得到更高的单个细胞产毒效率，但在高密度转染条件下容易结团，需要降低PEI的使用量，建议0.4-0.6 µg DNA/106cells；
3) 转染后丁酸钠的添加可以增加病毒滴度，但是也容易影响细胞活性，从而降低活细胞密度。
4) 通过上述三步优化，最终LV病毒滴度从1×106TU/ml提高到1×108TU/ml。
若收毒时采用灌流的方式，可以得到近一个数量级的病毒量的提升。
表2 过程优化对病毒总量（转染后Day4）的影响
Case2: 悬浮培养HEK293细胞包装AAV转染过程优化
腺相关病毒（AAV）载体是领先的基因传递平台，但载体的生产仍然是一个挑战。需要新的方法来提高AAV的产量并降低成本。过去提高AAV产量的努力集中在一次优化单个变量上，但是这种方法没有考虑到有助于向量生成的多个因素的相互作用。在这里，我们利用实验设计（DOE）方法来优化HEK293T悬浮细胞系统中的rAAV生产。
1、实验方法
1) 细胞株：HEK293T
2) 培养基：HyCell TransFx-H
3) 反应器：一次性搅拌式反应器XDR
4) DoE实验设计：
2、实验结果：
在转染时活细胞密度为1×106cells/ml条件下，结果显示一组独特的参数，转基因质粒的浓度更高，较短的孵育时间，丁酸钠的添加等条件，详述如下：
1) DNA浓度：1 µg/uL，借由案例1可知，高细胞密度下，可降低此值；
2) PEI/DNA比例：2，较高的比例并不能带来更好的病毒滴度；
3) 转染体积：5%，过高过低的转染体积均不利于转染效率；
4) 转染复合物孵育时间：20 min，过长的孵育时间，将使复合物体积变大，不利于其进入细胞；
5) 温度：37 oC;
6) DNA比例：Rep/cap:helper:transgen plasmid=1:1:2
7) 转染后丁酸钠的添加：5 mM，过多的丁酸钠会造成细胞活率的降低，但可以显著提高病毒滴度。
图5 DoE实验设计：转染条件（温度、孵育时间、转染体积、添加剂浓度）对转染效率的影响
图6 DoE实验设计：转染条件（DNA比例、PEI/DNA比例、DNA浓度、添加剂浓度）对病毒滴度的影响
图7 转染条件DoE实验中sweet spot界定
总结
规模化生产病毒载体的可靠工艺，是其临床转化的重要挑战，对于需要采用转染方式包装病毒载体的LV和AAV来说，其悬浮培养的方式将带来更便利的可放大性，那么对转染阶段的条件优化，包括转染时细胞密度，PEI/DNA比例，添加剂的使用等将显得尤为重要，此时可采用OFAT单因素法或者DoE的实验设计方式，必要时可采用灌流的方式用于细胞密度的扩增、代谢副产物的移除以及病毒收获。
一种被广泛使用的载体类型就是病毒载体，其已经进化为递送DNA（如腺相关病毒AAV）或RNA（如慢病毒LV）以复制到宿主细胞中。这些病毒载体都具有各自的优势，可采用贴壁培养、微载体悬浮培养（详见“应用微载体包装AAV病毒载体”）以及无血清悬浮培养等方式。无论如何，规模化生产病毒载体的可靠工艺，都是其临床转化的重要挑战。本文以需要采用转染方式包装病毒载体的LV和AAV为例，概述其悬浮培养HEK293细胞包装病毒载体的过程优化。
在此之前，先看一下各个病毒载体的特点以及外源基因进入细胞的方式。
各个病毒载体的特点
表1 不同病毒载体的特点
外源基因进入细胞的方式
常见转染方法:
· 化学转染：PEI、脂质体（昂贵）
· 物理转染：电穿孔、基因注射、显微注射（需要设备）
· 病毒：腺病毒、逆转录病毒
对于LV及AAV的转染过程，工业生产一般使用基于PEI的转染方法。细胞表面和DNA都带负电荷，PEI等转染试剂表面带正电荷，使用PEI包裹带负电荷的DNA，然后穿过带负电荷的细胞膜，进行病毒载体的包装。
图1 外源基因进入细胞的方式
Case1: 悬浮培养HEK293细胞包装LV过程优化
LV是出芽方式分泌，包装后的LV一般用于感染免疫细胞，使其表达出Car-T细胞Car的部分。
1、实验方法
1) 细胞株：HEK293SF-3F6
2) 反应器：一次性搅拌式反应器
3) 截留装置：0.8-0.45 µm
4) 培养方式：采用灌流培养的方式实现细胞密度的提高
2、实验结果：
2.1 转染时细胞密度对病毒滴度的影响
1) 转染时细胞密度：
LCD：1×106 cells/ml
HCD：5×106cells/ml
2) 采用灌流培养的方式实现细胞密度的提高，在使用LC-SFM培养基情况下，每天一个灌体积的灌流速率，可使细胞密度达到1×107 cells/ml，不仅增加了细胞密度，也移除了代谢副产物如乳酸、氨等。
3) 不管在LCD还是在HCD条件下转染，单个细胞产毒效率都在2 TU/cell左右。
4) 在LCD条件下，转染后3天病毒滴度达到峰值，约1×106 TU/ml，在HCD条件下，病毒滴度峰值可达5×106 TU/ml，转染时较高的细胞密度可以得到更高的病毒滴度。
病毒梯度，LCD（open bars），HCD（solid bars）。（B）细胞密度。总细胞计数（squares），活细胞计数（triangles），HCD（solid symbols），LCD（open symbols）
2.2 培养基对病毒滴度的影响
1) 优化培养基包括某品牌LC-SFM L; LC-SFM GL以及HyClone培养基SFMTransfx-293，代号HyQ。
2) 在使用LC-SFM L和 LC-SFM GL时，不论LCD还是HCD条件下，单个细胞产毒效率均为2 TU/ml。
3) 在使用HyQ (SFMTransfx-293)时，LCD转染条件下有很高的单个细胞产毒效率为6 TU/ml，但是HCD条件下，单个细胞转染效率减少为2 TU/ml，主要是因为HCD条件下，细胞结团严重，并在容器液面边缘形成一圈死细胞。造成这个现象的原因是PEI有一定毒副作用，为了降低PEI的使用量，降低原来1 µg DNA/106cells的使用量，选择0.4-0.6 µg DNA/106cells的使用量，转染后3天得到最高病毒滴度，为9×106TU/ml。
图3 不同类型培养基对LV生产的影响
转染阶段：HCD条件下使用LC-SFM L培养基 （solid grey bars）， HCD条件下使用LC-SFM GL培养基 （solid black bars），LCD条件下使用SFMTransfx-293培养基（open bars），HCD条件下使用SFMTransfx-293培养基（hatched bars）
2.3 转染后添加剂丁酸钠的浓度对病毒滴度的影响
1) 使用HyQ (SFMTransfx-293)培养基，在HCD转染条件下，转染后16h添加丁酸钠，优化其添加浓度，丁酸钠优化浓度范围为0.1-5 mM。
2) 转染后丁酸钠添加量大于2 mM时，会降低细胞密度；随着丁酸钠含量的增加，病毒滴度增加。在5 mM丁酸钠添加量条件下，转染后2天可达最大病毒滴度，为1×108 TU/ml。
图4 丁酸钠不同添加浓度对LV生产的影响，所有实验组均在SFMTransfx-293培养基中进行，在HCD条件下，使用0.4 µg DNA/106cells，丁酸钠使用量列于图中。
2.4 悬浮培养HEK293细胞包装LV过程优化汇总
1) 转染时，较高的细胞密度有利于提高病毒滴度；
2) HyClone培养基SFMTransfx-293能够得到更高的单个细胞产毒效率，但在高密度转染条件下容易结团，需要降低PEI的使用量，建议0.4-0.6 µg DNA/106cells；
3) 转染后丁酸钠的添加可以增加病毒滴度，但是也容易影响细胞活性，从而降低活细胞密度。
4) 通过上述三步优化，最终LV病毒滴度从1×106TU/ml提高到1×108TU/ml。
若收毒时采用灌流的方式，可以得到近一个数量级的病毒量的提升。
表2 过程优化对病毒总量（转染后Day4）的影响
Case2: 悬浮培养HEK293细胞包装AAV转染过程优化
腺相关病毒（AAV）载体是领先的基因传递平台，但载体的生产仍然是一个挑战。需要新的方法来提高AAV的产量并降低成本。过去提高AAV产量的努力集中在一次优化单个变量上，但是这种方法没有考虑到有助于向量生成的多个因素的相互作用。在这里，我们利用实验设计（DOE）方法来优化HEK293T悬浮细胞系统中的rAAV生产。
1、实验方法
1) 细胞株：HEK293T
2) 培养基：HyCell TransFx-H
3) 反应器：一次性搅拌式反应器XDR
4) DoE实验设计：
2、实验结果：
在转染时活细胞密度为1×106cells/ml条件下，结果显示一组独特的参数，转基因质粒的浓度更高，较短的孵育时间，丁酸钠的添加等条件，详述如下：
1) DNA浓度：1 µg/uL，借由案例1可知，高细胞密度下，可降低此值；
2) PEI/DNA比例：2，较高的比例并不能带来更好的病毒滴度；
3) 转染体积：5%，过高过低的转染体积均不利于转染效率；
4) 转染复合物孵育时间：20 min，过长的孵育时间，将使复合物体积变大，不利于其进入细胞；
5) 温度：37 oC;
6) DNA比例：Rep/cap:helper:transgen plasmid=1:1:2
7) 转染后丁酸钠的添加：5 mM，过多的丁酸钠会造成细胞活率的降低，但可以显著提高病毒滴度。
图5 DoE实验设计：转染条件（温度、孵育时间、转染体积、添加剂浓度）对转染效率的影响
图6 DoE实验设计：转染条件（DNA比例、PEI/DNA比例、DNA浓度、添加剂浓度）对病毒滴度的影响
图7 转染条件DoE实验中sweet spot界定
总结
规模化生产病毒载体的可靠工艺，是其临床转化的重要挑战，对于需要采用转染方式包装病毒载体的LV和AAV来说，其悬浮培养的方式将带来更便利的可放大性，那么对转染阶段的条件优化，包括转染时细胞密度，PEI/DNA比例，添加剂的使用等将显得尤为重要，此时可采用OFAT单因素法或者DoE的实验设计方式，必要时可采用灌流的方式用于细胞密度的扩增、代谢副产物的移除以及病毒收获。
