过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的制备工艺
实验设备
粒度分析及电位仪美国Brookhaven
紫外分光光度计日本岛津UV-2450
透射电子显微镜日本电子株式会社（JEOL）
超声细胞破碎仪南京先欧有限公司
微射流高压均质机美国Genizer
恒温水浴搅拌器IKA
分析天平日本岛津制作所
超滤杯德国Millipore8400
离心机德国Eppendorf
气相色谱仪日本岛津GC-2014C
实验方法
过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的制备工艺：
称取126.4mgKMnO4粉末溶解于12mL去离子水中，超声充分溶解。取5mL200mg/mL人血清白蛋白，加入去离子水稀释到28mL（使终浓度35.7mg/mL），放入37℃恒温水浴并搅拌情况下，将KMnO4溶液在5分钟之内逐滴加入到白蛋白溶液中，溶液颜色逐渐变为棕黑色，继续水浴磁力搅拌反应两小时。加入去离子水稀释制备的二氧化锰白蛋白纳米粒至100mL，超滤除去游离的KMnO4，反复超滤两次，直至流出液为无色透明，最终得到40mL二氧化锰白蛋白纳米粒体系。取7.22mLFDC与3.14mLFMCP，混匀后加入到稀释好的二氧化锰白蛋白溶液中，使用移液枪反复吹打多次使全氟化合物在体系中分散均匀，方便超声乳化。
将上述混合溶液置于冰浴，用超声细胞破碎仪以35%的功率超声4个循环（每个循环超声2分钟）共8分钟，得到过氧化氢响应性白蛋白纳米粒初乳。将初乳使用微射流高压均质机均质（以下百分数均为均质机总功率百分数），10%，1min；30%，1min；50%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，1min；65%，1min；10%，放出；20ml体系，均质一个循环用时20s左右，65%压力下共微射流均质4min，即12个循环。
设置不含二氧化锰的对照组纳米粒PHNs，制备流程如下：取5mL200mg/mL人血清白蛋白，加入去离子水稀释到40mL（使白蛋白终浓度为25mg/mL）。加入7.22mLFDC和3.14mLFMCP，反复吹打混匀后使用超声细胞破碎仪超声乳化，进而使用微射流均质机均质得到最终制剂PHNs。超声方法及微射流均质方法同上述制备过程。
结果
过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的制备工艺
在这里，我们使用了一种简单的一步原位生物矿化方法制备得到了二氧化锰白蛋白纳米粒，同时使用超声乳化方法将全氟化碳FDC和FMCP包裹在白蛋白疏水核心，得到具有供氧能力的过氧化氢响应性白蛋白纳米粒。如图1所示，过氧化氢响应性白蛋白纳米粒溶液在自然光线下看呈透亮的棕黑色，溶液体系澄清透亮，迎着光线看可见微微乳光
图1.过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的照片
过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的粒径分布及电位
经Brookhaven电位与粒度仪测定，PHNs与M-PHNs的粒径大小和分布情况如图2所示，电位大小如图3所示。可以看出，PHNs的平均水合粒径为148nm，表面电位为-24.7mV，相比较之下，修饰了二氧化锰的M-PHNs其粒径略微增大至157nm，表面电位下降至-30.7mV。同时，两种纳米粒的粒径多分散系数（PDI）均小于0.15，证明本研究中所用的纳米药物粒径分布较为均匀。实验结果表明我们所制备的M-PHNs纳米氧气发生器具有合适的粒径大小，适用于后续体内外实验。表面电位的负电性增大也能够证明二氧化锰的成功修饰，并且电位偏负电性的纳米粒由于在生物体中对细胞的非特异性吸附小使得这类纳米粒子具有优异的血液相容性，这些独特的理化性质为接下来细胞及动物模型中的探索奠定了基础
图2.过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的粒径分布情况
图3.过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的电位大小
过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的紫外吸收光谱
为了进一步验证M-PHNs中二氧化锰的存在，对M-PHNs及PHNs纳米粒进行200-900nm的全波长紫外-可见光扫描（图4），从图中可以看出，相比于没有二氧化锰的PHNs纳米粒而言，过氧化氢响应性白蛋白纳米粒在380nm左右有一个明显的吸收峰，与文献调研的二氧化锰的376nm的特征紫外吸收峰重合，而PHNs纳米粒在此位置并无明显吸收峰，从而验证了过氧化氢响应性白蛋白纳米粒中二氧化锰的存在。而200-300nm的高紫外吸收是由于纳米粒中的白蛋白引起的，这一位置的吸收曲线在M-PHNs以及PHNs的吸收图谱中高度重合
图4.过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的特征紫外吸收光谱
过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的气相色谱图
过氧化氢响应性白蛋白纳米粒中具有携氧释氧功能的核心是FDC和FMCP两种全氟化合物。由于全氟化合物是一种化学惰性物质，其疏水疏油的性质给全氟化合物的检测带来了巨大的困难。因此在本研究中，我们利用两种全氟化合物之间沸点的差异使用气相色谱检测的方法验证M-PHNs中FDC和FMCP的存在。其中，商品化的FDC是由顺式和反式两种同分异构体组成的混合物，因此，在气相色谱图中，FDC在保留时间7.5分钟左右有两个峰形相似的特征峰，代表FDC的两种同分异构体（图5b）。同样地，商品化的FMCP由于纯度为96%，因此在气相色谱图中有四个特征峰，保留时间分别为10.31分钟、10.44分钟、11.23分钟和11.39分钟（图5c）。对于待测样品过氧化氢响应性白蛋白纳米粒，从结果上可以看到样品的气相色谱图中同时具备FDC以及FMCP的特征峰，分别在保留时间7.29分钟、7.66分钟（FDC）以及10.28分钟、10.45分钟、11.11分钟、11.27分钟（FMCP），充分说明过氧化氢响应性白蛋白纳米粒样品中含有FDC以及FMCP 图5
图5.过氧化氢响应性白蛋白纳米粒的气相色谱图
