生物酶解处理对甲醇蛋白细胞破壁的影响
甲醇蛋白是以甲醇、磷酸等作为培养基，通过发酵形成的甲醇酵母细胞为单细胞菌体，再经提炼形成单细胞蛋白。从甲醇酵母细胞中所提取的单细胞蛋白产品安全无毒，其丰富的氨基酸含量是其他植物性原料所无法比拟的，是一种营养价值非常高的蛋白质产品。单细胞甲醇蛋白胞内可溶性蛋白质占细胞总蛋白质的比例达 95%以上。但是甲醇酵母细胞是由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等组成的网络结构，且胞壁较厚，结构坚韧，所以大部分并没有破壁，不利于胞内蛋白质提取。如果将其直接进行蛋白质提取，收率很低。而且提取物里面还含有大量的磷脂、核酸和多糖等杂质。因此，目前这类甲醇蛋白粗品主要作为饲料添加剂使用。
本文利用甲醇蛋白粗品经过碱溶、离心、破壁、酸沉制取纯化甲醇蛋白，研究了适合于甲醇酵母细胞破壁及纯化胞内蛋白质的方法，为甲醇蛋白的有效利用提供实验依据。
仪器和原料
高压均质机NanoDeBEE(苏州微流纳米生物技术有限公司);Q/SGYM1008电子天平;BD-1A-70冷冻干燥机;Delta320酸度计:梅特勒－托利多公司;TDL-5A离心机;DKS24恒温水浴锅;SHA－B水浴恒温振荡器。甲醇蛋白粗品:粗蛋白质50% 粗脂肪11.5%粗纤维7.4%水分18.5%粗灰分12.6%；酵母破壁酶（广西南宁庞博生物工程有限公司）;其他试剂均为分析纯。
试验方法
1.生物酶解处理：量取25%甲醇蛋白粗品溶液500mL，调节pH4.5后分装成5份，每份100mL。在甲醇蛋白粗品溶液中分别加入0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的酵母破壁酶，在水浴恒温振荡器中50℃保温12h。酶解结束后，测定细胞破壁率，然后离心收集上清液，并测定其中蛋白质含量。
2.热碱处理：量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL，调节pH至7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，分别置于60℃的恒温水浴中保温2h，每隔10min搅拌1次。热碱处理结束后，测定细胞破壁率，然后离心收集上清液，并测定其中蛋白质含量。
3.高压均质处理。量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL，在高压均质机中进行高压均质破壁，高压均质压力分别为80、120、160、200和240MPa。高压均质处理结束后，测定细胞破壁率，然后离心收集上清液，并测定其中蛋白质含量。
4.热碱－均质处理：量取2份25%甲醇蛋白粗品溶液各200mL，调节pH至9.0、10.0后，分别置于60℃的恒温水浴中保温2h进行热碱处理。热碱处理结束后分装成4份，每份100mL，分别在80、120、160、200和240MPa下进行均质处理。均质结束后，测定细胞破壁率，然后离心收集上清液，并测定其中的蛋白质含量。
5.甲醇蛋白酸沉纯化:最取5份500mL25%甲醇蛋白粗品溶液，选择适合甲醇蛋白细胞破壁处理方法，处理结束后离心收集上清液，用盐酸分别将上清液调节pH至3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，静置20min后，5000r/min下离心10min，即获得蛋白沉淀。将蛋白沉淀冷冻干燥后称重，并测定蛋白沉淀中粗蛋白质含量。
实验结果
酵母破壁酶是由β－葡聚糖酶、甘露聚糖酶及几丁质酶等复配而成，可降解细胞壁多糖，使胞内蛋白质释放出来。图1为生物酶解处理对甲醇蛋白细胞破壁效果的影响曲线。
图1生物酶解处理对甲醇蛋白细胞破壁的影响
从图1可以看出，随酶用量增加，甲醇蛋白细胞破壁率不断上升，酶用量在0.01%～0.04%时，细胞破壁率快速上升，蛋白释放量也迅速增加。但当酶用量大于0.04%时，上升趋势减缓，蛋白释放量增加不明显。但总体来看，生物酶解处理对酵母细胞破壁效果较差，最大破壁率仅约22%，蛋白释放量也较低。
图2热碱处理对甲醇蛋白细胞破壁的影响
从图2可以看出，pH低于8.0时，破壁效果较差。当pH升高，细胞破壁率迅速上升，在pH11.0时，细胞破壁率高达36.2%。蛋白释放量与细胞破壁率变化趋势一致。实验发现，当对甲醇蛋白粗品溶液热处理时间延长及碱性增强时，纯化蛋白颜色也不断加深，并伴随有硫化物的特殊气味，这可能是由于胞内蛋白质释放出来后，部分二硫键断裂，与碱反应变性所致。当均质压力增大至160MPa，细胞破壁率快速上升，蛋白释放量也迅速增加。
结果表明，热碱与高压均质联合处理法较生物酶解处理法、热碱处理法及高压均质处理法对细胞破壁效率高。综合生产成本及提纯蛋白的用途和性质等因素，本研究获得了热碱－均质处理的最适条件:采用Ph10.0，60℃热处理2h，160MPa压力均质3次，细胞破壁率可达97.6%;在pH4.5时，破壁后上清液蛋白沉淀量最大，所得纯化甲醇蛋白中粗蛋白质含量达到82.5%，纯化效果较为理想。
