自噬调节 FSS 诱导的肝癌细胞的上皮-间充质转化

肝细胞癌（HCC）是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。肿瘤的发生和发展是一个复杂的多因素过程，一般受癌细胞周围微环境的调控。

在肿瘤微环境中，0.1-2 dyne/cm² 的流体剪切应力（FSS）已被证实可促进肿瘤相关的血管生成和淋巴管生成，这可能会改善癌细胞的移动性和侵袭性。研究还表明，1.4 dyne/cm² 层流 FSS 可以显著增强 HCC 细胞的迁移。然而，机械应力如何调节细胞迁移的机制仍然知之甚少。

到目前为止，自噬在癌症进展中的作用已被广泛探索并且对包括FSS在内的多种微环境刺激具有响应性。根据之前的研究结果，1.4 dyne/cm² FSS 可以以时间依赖性方式诱导自噬的发生，随后通过整合素/细胞骨架通路促进 HepG2 细胞的迁移和侵袭。然而，参与FSS诱导的细胞迁移的下游通路仍需要进一步探索。

近年来，上皮-间充质转化（EMT）由于与癌细胞迁移和侵袭的密切关系而备受关注。自噬在 EMT 过程中也起着至关重要的作用。然而，在肿瘤进展过程中，尤其是在流体流动条件下，自噬和 EMT 之间是否存在相互作用尚不清楚。

鉴于自噬在癌细胞迁移和侵袭中的作用，来自四川大学华西基础医学与法医学院生物医学工程研究室、四川大学老年保健和医学研究中心的专家学者进行了深入研究，推断自噬可能涉及流体剪切应力诱导的 EMT。在研究中，对 HepG2 和 QGY-7703 细胞（人HCC细胞系）施加1.4 dyne/cm² FSS 以鉴定自噬和 EMT 的发生。相关研究成果发表在 Molecular Carcinogenesis  题为《Autophagy modulates FSS-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells》。

实验结果：

FSS在肝癌细胞中诱导自噬

为了进一步验证FSS对自噬发生的影响，对自噬相关标志物的表达进行了研究。如图1 B、C 所示，EBSS 饥饿诱导的 beclin1、ATG7 和 LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高，p62表达下调，而p62可被3-MA抑制。

在 HepG2 细胞中，与静态对照相比，FSS 刺激 1 和 4h 均能显著上调 beclin1、ATG7 的表达，以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值，表明 FSS 可以诱导 HepG2 细胞的自噬（图1 B )。在 QGY-7703 细胞中可以观察到类似的结果（图1 C）。

不同的是，在HepG2细胞中，beclin1、ATG7、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达和p62的下调在4 h时更为明显，而QGY-7703细胞在1 h时表达更明显。有趣的是，随着FSS持续时间的延长，自噬相关蛋白的表达可能会发生变化，其随细胞系的不同而表现出不同的时间依赖性。
 

图 1

FSS诱导EMT的发生

以往的研究表明，EMT的发生是对流体剪切应力刺激的响应。在本研究中，对HepG2和QGY-7703细胞分别施加1.4 dyne/cm² 流体剪切应力作用1和4 h。如图2 A所示，与静态对照组相比，FSS在 1 和 4 h 显著下调上皮标志物 E-cadherin 的表达，同时上调间充质标志物 N-cadherin、Vimentin、Twist 和 Snail 的表达，表明HepG2 细胞中 EMT 的发生。
 

图 2

抑制自噬影响FSS诱导的EMT相关标志物的表达和定位

最近的研究表明，自噬刺激可以通过调节癌细胞的上皮和间充质表型之间的转化来增加细胞迁移能力。因此，实验进一步探讨了自噬是否会在暴露于 FSS 时影响 EMT。

如图2 A所示 , 与相应的 FSS 组 (1 和 4 h 组) 相比, 添加自噬抑制剂 3-MA 导致 1 h + 3MA 组的 E-cadherin 水平恢复上调, 而HepG2 细胞中 1 h + 3MA 和 4 h + 3MA 组中 N-cadherin、Vimentin、Twist 和 Snail 水平均显著降低。同样，当3-MA阻断自噬后，QGY-7703细胞中E-cadherin表达升高，N-cadherin表达降低，也证实了EMT的衰减(图3 A)。
 

图 3

为了进一步证实这一结论，当暴露于 FSS 1h时，通过敲低 ATG5 或添加自噬抑制剂 CQ 来抑制自噬。结果表明，抑制自噬阻碍了 FSS 诱导的 HCC 细胞的 EMT。

总的来说，这些结果表明，自噬积极促进了 FSS 诱导的 HCC 细胞 EMT 的发生。

抑制自噬可阻断 FSS 诱导的 β-catenin 在细胞核中的积累

β-连环蛋白（β-catenin）是一种间充质标记物，它从E-钙粘蛋白分离到细胞质中，然后易位到细胞核中，对EMT有重要作用。为了进一步证实自噬在 FSS 诱导的 EMT 中的作用，在 HepG2 和 QGY-7703 细胞中检测了 β-连环蛋白的表达和分布。

结果显示，与静态对照相比，β-catenin 的表达水平在 FSS 刺激 1 h和 4 h内上调，而随着 3-MA 在两种细胞中的加入，β-catenin在细胞核内明显减少并易位至细胞膜，表明FSS诱导的自噬可以诱导β-catenin的核易位。

这些结果表明 FSS 可以促进 EMT 的发生，而 EMT 可以通过抑制自噬而减弱。

抑制自噬损害 FSS 诱导的细胞迁移

自噬已被证实正调控EMT的发生，实验假设自噬可能有助于HCC细胞的迁移。该研究采用F-肌动蛋白染色检测HCC细胞的迁移能力。结果表明，在 FSS 条件下，自噬的抑制显著阻碍了 F-肌动蛋白的聚集和重组，这是细胞迁移所必需的。

为了进一步证实自噬对 EMT 的影响，进行了伤口愈合试验以检测 HCC 细胞的迁移能力。当暴露于流体剪切应力时，在HepG2细胞中发现1和4 h组细胞的迁移距离分别长约1.4和1.5倍，而在QGY-7703细胞中，在24 h时，其迁移距离分别是对照组的1.2倍和1.3倍 (图 4)。

因此，1.4 dyne/cm2 FSS对HCC细胞的迁移有重要作用。然而，与 1 h和 4 h组相比，3-MA 的添加分别显著降低了49%和93%的HepG2细胞迁移距离（图 4）。同样，QGY-7703细胞的迁移距离分别降低了64%和47%，表明自噬参与了 FSS 诱导的细胞迁移，可能是通过诱导 EMT 的发生。
 

图 4

实验结论：

总之，该研究表明自噬参与了 FSS 诱导的 EMT，可以积极促进 HCC 细胞的迁移和侵袭。该研究结果提供了一种新的见解，用于说明肝细胞癌机械微环境中自噬和 EMT 之间的关系。

参考文献：Su G, Feng T, Pei T, Yang F, Sun D, Yu H, Wang X, Gao W, He J, Shen Y, Liu X. Autophagy modulates FSS-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells. Mol Carcinog. 2021 Sep;60(9):607-619. doi: 10.1002/mc.23327. Epub 2021 Jun 9. PMID: 34107107.

文章来源【Naturethink官网】

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