PeproTech胃上皮类器官培养的原理与方法

近年来，类器官培养热潮一直不断攀升，而胃类器官也受到大多数人的关注，胃类器官是一种衍生于胃干细胞或者多能诱导干细胞的类器官模型，体外培养的胃类器官含有多种细胞克隆亚群，其培养环境模拟活体内的真实微环境，因此胃类器官在细胞成分、组织构架及特定功能等方面与胃上皮组织高度相似，可实现在体外培养环境中对胃上皮组织的复制，为人类胃生理与疾病的研究提供了一个新的平台。

胃类器官的培养较为繁琐，特别是获取原始干细胞操作步骤较多，操作时间长，培养过程中也有些注意事项，对于初学者若不注意一些操作细节，很可能导致培养失败。所以PeproTech技术员实践总结了以下全面的操作流程，并强调在培养操作中的注意要点，以便您可以清楚透彻的get其培养方法，帮助大家提高培养的成功率。

3) 重复该重悬清洗步骤 5 ～10 次至上清液清亮，弃上清。
4) 最后一次漂洗后，吸除大部分上清液，向沉淀中加入含10 mM EDTA溶液(25 ml)室温消化60 min后，弃上清。
5) 加入10 ml冰PBS用移液管轻轻吹打几次，等待组织块沉淀下去，弃去上清，将组织块转移到10 cm²的培养皿中，在组织块上覆盖一个无菌的载玻片，戴上无菌手套，用两手的大拇指按压载玻片，将组织块腺体中的细胞挤压出来。

6) 加入PBS反复吹打培养皿和载玻片上的组织块，吹打后等待组织块自然沉降，小心吸取上清液并使用70 μm滤网过滤，将滤液收集于干净的50 ml管中。
7) 如果收集的细胞不够多，可以重复5)和6)步骤，将几份混合液以200×g离心5 min。小心地倒出并丢弃上清液。
配置类器官培养基：
在基础培养基中加入:

8) 将沉淀重悬于含有冰的类器官培养基中，吸取10 μL置于玻璃载玻片或血细胞计数器上。使用倒置显微镜，计数分离的细胞数目，200 g离心5 min，小心吸出并弃去上清。用类器官培养基重悬细胞至1.6 x10⁵个/ml
9) 将离心管置于冰上，吸取150 μL重悬好的细胞悬液，加入等体积的预冷的Matrigel，小心地上下吹打十次以充分混匀，注意避免产生气泡。
10) 吸取50 μL悬液，加入到提前预热的24孔板每个孔中的中心部位，样品应在每个孔的中心形成圆顶结构。为了防止接种时出现气泡，枪头内液体不要全部打出。分别接种24孔板4个孔。
11) 将培养板在37°C下静置10分钟以待基质胶完全凝固。将平板转放入培养箱时，应注意不要破坏凝固后的液滴。
12) 使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500 μL室温(15-25℃)的配置的类器官培养基。不要将培养基从圆顶结构上直接加入。
13) 向其它未接种的孔中加入无菌PBS以保证培养时的湿度。 
14) 将培养板的盖子盖好，并在37℃和5％CO₂下进行培养。
15) 每隔2天进行完全换液。换液时将移液枪头放在孔底边缘小心地将原有液体培养基吸出，并加入为500 μL新鲜的室温类器官培养基。
16) 在培养第7至10天以1:3~1:6的比例进行类器官传代，以避免在类器官过度生长和空腔内积累过量的碎屑。

1) 在成熟类器官的24孔板中，每孔加入约1000基础培养基，使用无菌细胞刮刮取孔板中的基质胶，收集每个孔中的悬液置于15 ml离心管中；
2) 将可以传代的类器官冰上放置5～10 min；用1 ml大枪头吹打将基质胶打碎，吹打30下左右，此过程避免产生气泡（调制量程到700 μL可避免气泡产生）， 可取适量的悬液观察，直至大部分类器官结构解离。其后步骤同胃类器官的制备方法中9)～13)
注：传代中，若隐窝状态良好可进行1:3传代，若状态较差可进行1:1传代。全程可以维持约3个月的长期传代扩增，且类器官状态保持良好。

1) 胃解剖上可分为胃底、胃体、胃窦、幽门（小鼠胃还拥有前胃部分），对应的胃上皮可以分为胃底/体腺和胃窦/幽门腺两部分，两者在细胞构成上差别较大。它们均含有表面黏液细胞、颈粘液细胞、干细胞、内分泌细胞；但胃底腺含有壁细胞（分泌盐酸）和主细胞（分泌胃蛋白酶），而胃窦腺不含有这两种细胞组分。胃底腺和胃窦腺均可以构建成胃上皮类器官。胃腺体内的干细胞能够分裂、分化，自发形成球囊状结构；囊壁上含有所有腺体内的细胞成分。囊内为上皮的腔面，内含脱落细胞、分泌物等；囊外为上皮的基底面，为细胞外基质成分。
2) EDTA消化液需要用无钙无镁的PBS溶液进行稀释，否则影响EDTA的螯合作用。