切向流过滤浓缩/洗滤慢病毒样颗粒
来自美国维克森林大学和安徽师范大学的科学家们在2019年的《Nucleic Acids Research》杂志上发表了题为“Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing”的文章。文中，研究人员指出CRISPR/Cas9机制的瞬时表达不仅可降低脱靶导致的突变风险，还可降低针对Cas9蛋白质的潜在免疫反应，而其新近开发的系统通过适体和适体结合蛋白（ABP）之间的特定相互作用，可在单个慢病毒样颗粒（Lentivirus-Like Particle, LVLP）中包装达100个Cas9 mRNA 拷贝，基于此，研究人员开发了一种基于慢病毒衣壳的生物纳米颗粒系统，其可高效包装Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）。结果显示，用一个com 适体替代sgRNA支架的四聚体，可保留向导RNA的功能，com-修饰的sgRNA可通过ABP和适体以及sgRNA和Cas9蛋白质之间的特定相互作用，将Cas9/sgRNA RNP包装进慢病毒样颗粒。这些RNP生物纳米颗粒可在不同细胞中的不同靶点上产生插入和缺失，其效率与研究人员此前报道的Cas9 mRNA LVLP相当或更好。新系统反应快速，可降低脱靶率，使其在递送Cas9 RNP用于瞬时Cas9表达和有效基因编辑时更方便、高效。
实验中，研究人员使用HEK 293T细胞培养生产Cas9 RNP LVLP。培养结束后，使用KrosFlo® Research 2i 切向流过滤系统，以浓缩-洗滤-浓缩模式浓缩含有LVLP的上清液，简单来说，150-300mL 上清液先浓缩至~50mL，以500-1000mL PBS洗滤，最后浓缩至~8mL。中空纤维组件材质为mPES（改性聚醚砜），MWCO为500kD。D02-E500-05-N组件的流速和压力维持为80ml/min和8psi，C02-E500-05-N的流速和压力维持为10ml/min和5psi。
原文：P.Lyu, P.Javidi-Parsijani, A.Atala, et al., Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research, 2019, doi:10.1093/nar/gkz605.
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