Y迷宫、水迷宫检测对匹罗卡品致痫大鼠空间学习记忆的影响

Y迷宫、morris水迷宫-SB-271046SB-271046对匹罗卡品致痫大鼠空间学习记忆的影响
SB-271046对匹罗卡品致痫大鼠空间学习记忆的影响

摘要:

目的：观察5-羟色胺6受体拮抗剂SB-271046对匹罗卡品致病大鼠空间学习记忆的作用效应。

方法：成年雄性SD大鼠分为两组:空白对照组,氯化锂-匹罗卡品组。首先根据注射氯化锂-匹罗卡品后是否出现癫病持续状态，出现癫病者纳入实验，未出现癫病和死亡者则剔除;然后再随机分为3组:模型组即侧脑室注射羟丙基-环糊精;药物组按不同剂量分为2组，即侧脑室注射SB-271047剂量为10 ug,4ul和侧脑室注射SB-271046剂量为20ug, 4ul。

结果：在Y迷宫自主交替行为实验中，模型组自主交替率显著下降(P<0. 01}，药物组显著提高尤其是20ug；剂量组(P < 0. 05)。在Y迷宫新奇事物探索实验中，模型组的新臂时间比显著下降(P < 0. 01)，药物组有提高趋势(P >0.05)。在Morris水迷宫定位航行实验中，模型组平均潜伏期延长显著延长(P <0.01），药物组明显缩短尤其是20ug剂量组(P < 0. 05)。在Morris水迷宫空间探索实验中，模型组平均潜伏期延长，穿越平台次数减少，原平台象限停留时间缩短(P < 0.05），药物组有改善趋势(P > 0.05)。

结论：SB-271046可以改善癫病大鼠的空间学习记忆，主要作用于记忆获得巩固阶段，20ug剂量作用明显。

关键词:癫病;5 -HT6受体;SB-271046;Morris水迷宫;Y迷宫

   癫痫患者合并认知功能障碍越来越得到人们的关注，不论是在临床研究还是动物模型研究中都有大量的报道。目前研究表明5-HT与癫痫关系密切，其可能通过受体起作用。大量的研究表明5-HT6 R拮抗剂可以改善认知功能，有些5-HT6 R拮抗剂已经作为治疗阿尔茨海默病AD的药物。然而这些相关研究大部分都是在痴呆模型上进行的，在癫痫模型上的学习记忆相关研究目前国内外较少报道。因此我们通过建立匹罗卡品慢性癫痫模型，然后侧脑室注射5-HT6 R拮抗剂SB-271046 (10ug；20 ug)。最后予Y迷宫、Morris水迷宫来检测SB-271046对癫痫大鼠学习记忆的影响，为临床上癫痫患者的学习记忆障碍的治疗提供新的思路。

1材料与方法

1. 1化学药品及实验仪器  氯化锂(Sigma公司)，匹罗卡品(Sigma公司)，10%羟丙基书环糊精(溶解SB-271046用，Sigma公司)，SB-271046 ( Tocris公司)，脑立体定位仪(上海欣软信息科技有限公司)、Y迷宫、Morris水迷宫系统(上海欣软信息科技有限公司)。

1.2实验动物分组 清洁级雄性SD成年大鼠，由中科院斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证号:SCXK（沪）:2007-0005。大鼠体重200-250g} 10-13 w龄，12 h光照，12 h黑暗，自由摄取水和食物。动物房温度保持在22一26℃。实验动物按照随机法首先分为2组:空白对照组(Vehicle) 10只，匹罗卡品组(PILO) 40只;然后根据腹腔注射PI-LO后是否出现四级及四级以上发作(Racine分级)，未达到者予以剔除，达到者纳入实验;;4 w后再将存活的PILO组按照随机数字表分为:模型组(HP-CD)即侧脑室注射HP-CD4ul组;10ug -SB组即侧脑室注射SB 271047剂量为10ug，4ul;20ug-SB组即侧脑室注射SB 271046剂量为20 ug，4ul。

1.3 LiC1-PILO癫痫动物模型建立  于腹腔注射氯化锂(LiCl) 127 mg/kg，16-18 h后腹腔注射PILO 30 mg/kg，在给药PILO前30 min，腹腔注射阿托品1 mg/kg，以缓解PILO的外周胆碱能效应。连续观察30 min，根据Racine分级，发作级数达到四级及四级以上并持续30 min以上的即造模成功。不成功者按照原剂量每30 min追加1次，追加3次仍不成功者，剔除。造模成功的大鼠60 min后，予以地西伴10 mg/kg解痉，解痉效果不佳者按原剂量每60 min追加一次。存活大鼠腹腔注射平衡葡萄糖盐水5 ml/只，2次//d，连续3d，同时予以流质饮食。

1.4侧脑室注射5-HT6R拮抗剂SB-271046 大鼠造模成功后4 w，予10%水合氯醛深度麻醉，在脑立体定位仪帮助下，按照Watson《大鼠脑立体定位图谱》，侧脑室(前囱后0. 8 mm，旁开1.5 mm,深度4 mm)注射药物。HP-CD组注入10% HP-P-CD4ul；10ug-SB组注入SB 271046，2.5 ug/ul，4ul;20ug- SB组注入SB 271046 ，5ug/ul，4ul。注射时间维持4 min，速度1ul/ min。手术后恢复1 w。

1.5  Y迷宫、Morris水迷宫测评 造模成功后6w进行Y迷宫、Morris水迷宫实验，检测大鼠空间学习记忆。

    Y迷宫装置是由3个等长的黑色臂和一个中间区域组成，各臂互成120度，臂长50 cm，宽10 cm，高20 cm，支架高50 cm。动物放入后，采用Supermaze软件采集图像和分析数据。Y迷宫为时2 d，方法学按Robert，Dellu等的描述。1d为自主交替实验，每只大鼠从同一个臂即起始臂放入，连续自主交替8 min，检测自主交替自主交替率。每只大鼠结束后放回笼子，在进行下一只实验时，用75 %的酒精消除Y迷宫臂内的气味。交替率%=交替次数/(总次数-2)%。2d为新奇事物探索实验，采用4h间隔，先随机封闭一个臂，让大鼠在剩余的两个臂中自由探索10 min，4 h后打开挡板，每只大鼠自由探索5 min，记录大鼠进入各臂的次数和时间，尤其是新臂的次数和时间。每只大鼠结束后放回笼子，进行下一只前同样用75%酒精消除气味影响。

    Y迷宫实验结束后2 d进行Morris水迷宫实验。水迷宫方法学按照Charles等描述的方法。实验总共历行6 d。1-5 d为定位航行实验，每只大鼠每天进行4个象限，记录在120 s内找到平台的时间(逃避潜伏期)、速度、路程等;6 d撤离平台，记录大鼠 120 s内在目标象限(原平台所在象限)停留的时间、穿越平台(原平台所在位置)次数等。

1.6统计学方法 Y迷宫、Morris水迷宫实验所有数据以X+s表示，统计均采用SPSS 21. 0软件进行，P<0.05有统计学意义。各组间均数如符合正态性分布及方差齐性检验的，均采用单因素方差分析，各组间多重比较采用Tukey's检验;不满足正态性分布而方差齐性时，采用Welsh检验，多重比较采用Tukey ' s检验;二者均不满足时采用非参数Kruskal Wallis检验，各组间多重比较采用Nemenyi法检验。

2结果

    2. 1实验大鼠存活 Vehicle组10只大鼠全部存活。造模组40只大鼠，注射PILO后成功出现四级及四级以上并持续30 min的有34只，6只再追加3次后仍失败，剔除。成功率为85 %。由于急性期大鼠易死亡，但2 w后大鼠基本稳定，死亡率大大下降，故在2 w后统计成功SE的大鼠，存活24只，死亡10只，死亡率29.4%。4 w后进行侧脑室给药，至6w后行为学实验时，HP-CD组、10ug- SB组和20ug -SB组各死亡2只。故最后行为学的大鼠共28只，Vehicle组10只，HP}D组6只，10ug- SB组6只，20ug- SB组6只。

2. 2  Y迷宫测评

2. 2. 1   Y迷宫自主交替行为实验，检测在8min内各组大鼠的自发性交替率，见图1

2. 2. 2  Y迷宫新奇事物探索实验，检测各组大鼠在各臂的时间，尤其是新臂的时间。 

2.3   Morris水迷宫测评

2.3.1   Morris水迷宫定位航行实验中，连续进行5d，测定大鼠空间学习记忆的获取阶段的学习能力，主要测定大鼠找到隐蔽平台的潜伏期。

3讨论

    临床上癫痫患者的记忆损害的类型多样，如言语性记忆，片段性记忆，空间记忆等;同样，在PILO癫痫动物模型上也有类似发现。研究表明Y迷宫自主交替实验可以检测动物空间工作记忆，Y迷宫新奇事物探索的场地再认实验可检测片段式记忆，水迷宫实验可检测空间参照记忆和空间工作记忆。因此本实验建立LiCl-PILO癫痈模型，采用Y迷宫和水迷宫来研究癫痫大鼠的学习记忆是合理的。在连续8min的Y迷宫SAB中，HP-CD组其自主交替率显著下降，提示其学习记忆能力的严重受损，可见癫痫大鼠其学习能力下降，这与临床上癫痫患者空间学习记忆和短时记忆受损表现是一致的;药物组提高，尤其是20ug剂量，提示药物具有改善癫痫大鼠学习记忆的能力。在Y迷宫新奇事物探索4h间隔的实验中，在Vehicle组其新臂时间明显延长，而且大于随机概率33. 33%，提示其学习提取再现能力是正常的;而HP-CD组却明显缩短，并且与随机交替率33. 33%相比，明显下降(P <0. 05，表现出不能识别新臂，提示其学习记忆的提取再现能力严重受损。4组的新臂时间比较，发现HP-CD组明显下降为26. 15%，可见癫痫大鼠空间记忆能力受损，尤其是记忆提取再现过程受损;而药物组新臂时间是延长的，尽管未达统计学意义，这可能提示5-HT6受体拮抗主要作用于记忆的获得阶段而非提取再现阶段。这与Costa等的结果一致。他们发现5-HT6R拮抗剂可以改善年轻成年鼠的记忆获得巩固阶段，并可逆转老年鼠因年老而造成的记忆巩固能力的缺陷。

在Morris水迷宫定位航行实验中，大鼠在每天4次的实验中，几乎都是第1次的潜伏期最长，而后逐渐缩短，而且随着天数增加，每天的平均潜伏期也是不断缩短的，尤其是Vehicle组和20ug -SB组，其5d的平均潜伏期明显缩短(P < 0.05)。这就提示了Vehicle组和药物20ug组的大鼠其学习记忆能力是良好的，能形成对平台位置的长期记忆并能提取储存的空间记忆。HP-CD组的大鼠在2d-5d的试验中，其每天4次的试验的潜伏期无明显的变化，并且5d平均潜伏期改变未达统计学意义，这就提示了HP-CD组大鼠对平台位置不能形成长期记忆或者提取存储的空间记忆受损。10 ug -SB组5d的平均潜伏期也是逐渐缩短的，尽管未达统计学意义，提示其改善作用不明显。总体上，HP}D 5 d的平均潜伏相对正常组是延长的，而药物组可以改善其表现，尤其是20ug剂量组(P<0.05)，提示可能存在剂量依赖性。这与Foley等的结果一致，他们发现SB-271046可以改善大鼠在Morris水迷宫的表现，可改善空间记忆的获得阶段。Morris水迷宫6d的空间探索实验中，HP-CD组其潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少，在原平台象限停留时间明显减少，表明了其学习记忆提取再现能力的受损，与Inostroza等的结果一致，他们发现LiC1-PIL0癫痫模型的大鼠在空间学习记忆的获得和维持能力明显受损。药物组尽管还尚达到统计学意义，但具有明显改善的趋势，提示药物在记忆提取再现阶段的作用不强，与King等结果大体一致。

    综上，我们的实验结论是5-HT6R拮抗剂SB-27046可以改善癫痈大鼠的学习记忆障碍，尤其是作用于记忆获得巩固阶段，可能具有一定的剂量依赖，其改善学习记忆的作用机制目前国内外包括我们课题组正在进行研究，如我们正在进一步深入研究5 -HTR6受体介导mTOR通路在慢性癫痈模型的学习记忆等相关方面的分子学机制，为临床上癫痫合并认知功能障碍的患者的治疗提供新思路。