旷场实验相关文献-基于脾气虚的脾阳虚大鼠模型的复制方法及评价标准研究

基于脾气虚的脾阳虚大鼠模型的复制方法及评价标准研究

【摘要】　目的：研究阶段式大鼠脾阳虚证模型的复制方法及客观评价标准。方法：32 只 SPF 级雄性SD 大鼠随机分为对照组和脾阳虚证模型组（模型组），每组 16 只。模型组大鼠采用两段式造模方法；第1 阶段，即前 15 d 施加饮食不节和力竭游泳刺激；第 2 阶段，即后 7 d 每日早晚 2 次灌服番泻叶。为质控造模过程，以临床辨证要点为基础，建立了大鼠脾气虚和脾阳虚证的评价标准，并进行客观评价。结果：与对照组比较，模型组大鼠在第 1 阶段出现了消瘦、食少、神疲和乏力等症状，表明大鼠处于脾气虚状态；在第 2 阶段，上述变化更加严重，且有畏寒、便溏等症状，提示大鼠处于脾阳虚状态。结论：本研究中采用的两段式造模方法和模型评价标准，能够成功复制大鼠脾阳虚证模型。

【关键词】　脾阳虚；　脾气虚；　动物模型；　大鼠；　评价标准

脾阳虚证是中医证候研究的重要内容，其大鼠模型的复制方法有单因素法和复合因素法，因后者更好地模拟了该证的病因病机，目前应用较多，但还存在一些急需解决的问题。首先是模型的局限性问题。因为脾阳虚证的病因病机复杂，难以全面模拟，所以现有模型实为有限模型，并不具备脾阳气证的全部内涵，必须加以限定。其次是模型复制的质控问题。复合因素造模法多为两段式，即先复制脾气虚，再复制脾阳虚，而模型评价仅涉及脾阳虚，缺乏过程管理。为解决上述问题，本研究先后模拟脾气虚证和脾阳虚证的主要病因病机，并建立了阶段性评价标准以质控，成功复制了脾阳虚证的有限模型，特报道如下。

1　材料与方法

1.1　实验动物与分组　32 只 SPF 级雄性 SD 大鼠，体质量（200±10）g，购于辽宁省本溪市实验动物中心 [SCXK（辽）-2010-0001]，随机分为对照组和脾阳虚证模型组（模型组），每组 16 只。大鼠饲养于辽宁中医药大学实验动物中心 [SYXK（辽）-2013-000-9]，室温 18~23 ℃，相对湿度 45%~55%，自由饮水进食，适应性饲养 1 周后，开始实验。

1.2　模型复制方法　第 1 阶段（phase 1， P1），按文献 [12] 方法复制脾气虚证模型（饮食失节＋劳倦型），即模型组大鼠在 15 d 内：（1）先饱食 1 d，再禁食 2 d，均不禁水，共 5 个循环；（2）每日水温35~37 ℃游泳至力竭。第 2 阶段（phase 2， P2），复制脾阳虚证模型（苦寒泻下型），即每日灌服 20% 番泻叶水浸剂（2 m L/100 g），早晚各 1 次，连续 7 d。

1.3　模型评价标准　以大鼠的生物学特征为基础，根据临床辨证要点，拟定脾气虚证的评价标准：消瘦，食少，神疲，乏力；脾阳虚证模型评价标准：前述标准加畏寒、便溏。

1.4　模型评价方法　分别在 P1、P2，每组取 8 只大鼠进行评价。

1.4.1　代谢水平评价　上午 9~10 时测量其体质量以评价消瘦；测肛温以评估畏寒；单只放入代谢笼24 h 后计算进食 / 水量，即投食 / 水量 - 剩余量，以评价食少；按文献 [12] 方法收集粪便，检测大便含水率，即（大便湿重 - 大便干重）/ 大便湿重×100%，观察便溏情况。

1.4.2　神疲评价　采用Supermaze动物行为学实验系统（上海欣软信息科技有限公司），按文献 方法进行检测，即将大鼠放入箱体中心，观察 5 min 内大鼠的运动距离和站立次数，彻底清洁箱体后，检测下一只大鼠。

1.4.3　乏力评价　采用 YLS-13A 大小鼠抓力测定仪（济南益延科技发展有限公司）检测前肢抓力。先用右手将大鼠按放在抓力板上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手轻轻松开抓力板，待大鼠用力抓住抓力板时，及时加力后拉，以得到最大抓力。专人连续测量 3 次，取平均值。

1.5　统计学处理　采用 SPSS 17.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料以（x-±s）表示，比较采用单因素方差分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

2.1  大鼠代谢水平  由表 1 可见，与对照组 P1 比较，模型组 P1 大鼠的体质量、进食量和进水量均下降，该组大鼠出现消瘦和食少；与对照组 P2 比较，模型组 P2 的体质量、肛温、进食量和进水量均减少，该组大鼠出现了消瘦、畏寒和食少，而大便含水率增加，该组大鼠出现便溏；与模型组 P1 比较，模型组 P2 的体质量和肛温均下降，但大便含水率升高。

2.2  大鼠神疲乏力情况  图 1 和表 2 可见，对照组P1 和 P2 比较无明显差异，大鼠活动区域大，运动距离远，站立次数多，前肢抓力大；与对照组 P1比较，模型组 P1 和 P2 的活动区域明显变小，运动距离、站立次数和前肢抓力均明显下降，提示两组大鼠出现了神疲和乏力现象；与模型组 P1 比较，模型组 P2 的活动区域更小，甚至没有形成闭合运动轨迹，上述 3 个指标均降低，表示该组大鼠的神疲和乏力更加严重。

3　讨论

动物模型是中医证候研究的重要内容，其复制过程应符合中医理论，不能单纯进行症状模拟，还应考虑病因，甚至是模拟相关病机。通常认为，脾阳虚的发生多源于脾气虚，也可因外寒直中、苦寒伤阳和肾阳不足。由于病因较多，本研究仅选择了脾气虚和苦寒伤阳两个进行模拟，即以脾气虚大鼠为对象，通过灌服番泻叶，达到损伤脾阳的目的。而在复制脾气虚模型时，首先考虑的仍然是病因病机。诱发脾气虚的病因有饮食不节，劳倦过度，忧思日久，禀赋不足，素体虚弱，年老体衰，大病初愈，调养失慎等。还是由于病因较多，本研究选择了较为常见的饮食不节和劳倦过度进行模拟，即采用饱食 1 d，饥饿 2 d，结合每日力竭游泳，造成脾气虚。因此，本实验在复制脾阳虚模型的过程中，先后施加的因素有饮食失节、劳倦过度和苦寒伤阳，分别模拟了脾气虚和脾阳虚证的部分病因病机，同时也限定了本实验所复制的脾气虚为饮食不节和疲劳型，脾阳虚为脾气虚和苦寒伤阳型。

由于模型复制为阶段性，其评价也应分阶段进行，从而有效质控模型复制过程。本研究依据二证的临床辨证要点，结合大鼠的生物学特征，建立了较为简便易行的模型评价标准。首先根据脾气虚的临床辨证要点，即食少、腹胀、便溏及气虚证等，建立大鼠脾气虚的评价标准为：消瘦，食少，神疲，乏力；其次根据脾阳虚的临床辨证要点，即脾气虚的症状加虚寒证，设立大鼠脾阳虚证的模型评价标准为：消瘦，食少，神疲，乏力，畏寒，便溏。实际上，后一评价标准为前一标准加上畏寒和便溏，即脾气虚加寒象，这体现了模型评价的连续性。依此标准，本研究在造模的 P1 和 P2 进行阶段性评价。探索客观简便的模型评价方法一直是中医证候模型研究的重要内容，其目的是减少主观因素对实验的干扰，提高模型复制的成功率，确保模型复制的稳定性，从而保证实验结果的可重复性。针对上述评价标准，本实验建立了较为客观和简便的检测方法，以评估大鼠的类人症状。实际上，目前已经能够通过检测大鼠的体质量、肛温、进食 / 水量和大便含水率等，分别对消瘦、畏寒、食少和便溏等进行量化评价。本实验结果显示，模型组 P1 的体质量、进食 / 水量均低于对照组 P1，但肛温和大便含水率无明显变化，表明大鼠在接受 15 d 的饮食不节和力竭游泳刺激后，出现了消瘦和食少，但无畏寒和便溏现象；模型组 P2 的体质量、进食 / 水量、肛温均

低于对照组 P2，且大便含水率显著增加，说明该组大鼠出现了消瘦、食少、畏寒和便溏等类人症状。

与上述指标不同，“神疲”和“乏力”属于自述性疲劳症状，仅凭目测难以客观判定大鼠的疲劳程度，特别是难以区分二者在脾气虚和脾阳虚中的差别。本课题组前期工作提出，“神疲”和“乏力”均属于疲劳范畴，但前者主要是中枢性，后者则为外周性，可以分别采用旷场实验和检测大鼠双前肢抓力进行客观评价。本实验观察到，对照组 P1和 P2 大鼠进入检测箱后，更多地活动于四周较暗区域，并有快速通过中心强光区域的现象，其运动距离远、站立次数多，显示这些大鼠能够准确感知不同区域的光照强度，具有明显的趋暗现象，并对新鲜环境表现出较强的探索能力，反映了大鼠的中枢神经系统处于明显兴奋状态。与此相比，模型组P1 和 P2 的活动范围小，运动距离和站立次数均显著降低，提示大鼠中枢神经系统的兴奋度程度较低，探索“意愿”较差，处于“神疲”状态。在大鼠双前肢抓力方面，结果显示模型组 P1 和 P2 的前肢抓力分别低于对照组 P1 和 P2，提示大鼠出现“乏力”表现。

汇总上述实验结果，可以看出，模型组 P1 的体质量、进食 / 水量、旷场中运动距离和垂直活动次数，以及前肢抓力等，均显著低于对照组 P1，表明该组大鼠出现了消瘦、食少、神疲和乏力等类人症状，处于脾气虚状态。而模型组 P2 的上述指标与肛温均显著低于对照组 P2，且大便含水率显著增加，说明该组大鼠除了产生脾气虚的类人症状外，还有畏寒和便溏现象，已经处于脾阳虚状态。此外，通过模型组 P1 和 P2 之间的比较，还可以发现脾阳虚时大鼠的体质量、肛温、运动距离和站立次数明显低于脾气虚，大便含水率显著高于脾气虚，但两者在进食 / 水量方面没有明显差异，这些说明从脾气虚发展为脾阳虚时，尽管大鼠的纳少症状没有进一步加重，但大鼠更加消瘦，神疲和乏力更为严重，并出现了畏寒和便溏等较为明显的寒象。

综上所述，本研究所采用的阶段式造模方法和评价标准，能够成功地复制大鼠的有限性脾阳虚证模型，并且在消瘦、神疲、乏力、畏寒和便溏等方面与脾气虚进行有效区分。