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生物标志物研究与早期药物研发基因表达分析功能学检测RealTime ready 应用

浏览次数:6181 发布日期:2011-11-2  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

生物标志物研究与早期药物研发基因表达分析功能学检测RealTime ready应用

 

Sabine Lohmann*, Andrea Herold*, Tobias Bergauer#, Anton Belousov+, Gisela Betzl *, Manuel Dietrich*, Manuela Poignée-Heger *, David Geho’, Martin Weisser+

*Roche Applied Science, Penzberg, 德国
+Roche Pharma, Penzberg, 德国
#Roche Pharma, Basel, 瑞士
 ’Roche Pharma, Nutley, 美国

 

前言

生物标志物与早期临床药物研发抗-TWEAK复合物研发举例
TWEAK(肿瘤坏死因子样细胞凋亡弱诱导因子)是一种多功能细胞因子,可控制包括细胞增殖、迁移、分化、凋亡、血管生成,以及炎症在内的多种细胞活动。TWEAK通过与Fn14结合发挥作用,Fn14  是一种具有高度诱导性的细胞表面受体,与包括细胞核因子- kB(NF-kB)途径在内的多种细胞内信号途径具有相关性(2)。

Anti-TWEAK (RO5458640) 是一种直接针对TWEAK的重组人化 IgG1κ单克隆抗体。RO5458640 可与 TWEAK 结合,从而阻断 TWEAK 与受体结合。Fn14:抑制TWEAK:Fn14 信号途径与相应下游作用可促进肿瘤生长 (3)。

TWEAK 可与细胞外受体 Fn14 结合,通过 NF-κB 途径,
TWEAK与 Fn14 的结合可诱导信号转导。


根据文献搜索与TWEAK信号转导途径生物学芯片数据,应用“关键词”搜索功能,于RealTime ready配置门户网完成一个RealTime ready NF-kB定制型多孔检测板的配置。为生成首个假设,使用RealTime ready NF-kB panel,于9种不同的肿瘤细胞系(经过处理细胞系对未处理细胞系,于不同时间点,共使用 54 份样本)中,进行体外基因表达分析。根据细胞系结果,使用简化 NF-kB panel(35种参数),确认体内小鼠移植模型中的潜在生物标志物。基于细胞系与移植物测定结果,鉴定出13种潜在性、候选基因。为对假设进行检验,从上述参数中筛选出 6 种参数,进行人FFPE样本分析。上述6种参数与所选参考基因适合于感兴趣的实体肿瘤(BC、CRC、NSCLC、肉瘤、RCC)。已经开发出RealTime ready qPCR检测,并已经进行FFPET RNA分离功能的优化。

个体化医疗(PHC)根据基因信息,针对个体的遗传独特性,对个体进行卫生保健、疾病预防与治疗服务,满足个体需要。对特定生物状态指示剂的生物标志物分子的识别与鉴定,在个体化医疗中具有重要作用(1)。因此,生物标志物是药物从靶点鉴定至药物应用生命周期的核心元素。前列腺素特异性抗原
(PSA)、c-反应蛋白(CRP),与HER2/neu仅是众多生物标志物分子中的少数几个。


生物标志物研究中,人们对复杂生物背景下mRNA表达研究抱有浓厚兴趣。RealTime ready RT-qPCR检测与RealTime ready 配置门户网站在线完成相关标志物基因的选择,qPCR功能检测有助于了解基因表达概况。LightCycler®480多孔板上RealTime ready 定制型检测多孔板上含有用户选择的、预置人、小鼠或大鼠靶序列qPCR检测(https://configurator.realtimeready.roche.com)。我们已经建立起细胞系(体外)、移植小鼠模型(体内),与各种人类研究样本FFPET切片生物标志物研究的基因表达分析工作流。

生物标志物研究RealTime ready qPCR检测。可满足不同检测质量要求。生物标志物在治疗性药物复合物研发周期全程均非常重要(TWEAK复合物研发仅是一个例子。LightCycler® 480 real-time PCR 平台联合使用。

 
材料与方法
 
细胞培养
于标准条件下进行肿瘤细胞系(ACHN、Caki、SJSA、PANC-1、MDA-MB231、AsPC-1、SK-MES、NCI-H322M、22RV1)培养。使用TWEAK或 Anti-TWEAK(RO5458640)分别对细胞进行处理。于不同时间点收集肿瘤细胞系(0、6、24 小时),将RNA样本存放(Qiagen)。

细胞 RNA 分离
使用MagNA Pure LC 仪、MagNA Pure LC RNA Kit –High Perfor-mance(Roche,货号:03 542 394 001),与MagNA Pure LC 程序“RNA HP Cells”从细胞小球中分离总体细胞 RNA。溶解并混合细胞裂解物(1 x 106细胞每 600 µl RLT 缓冲液[Qiagen,货号:79216]),并将 2 x 200 µl细胞裂解物转移至MagNA Pure Sample Cartridge wells(200 µl每孔)。洗脱裂解液重复分离制备的 RNA 至 50 µl,并收集洗脱液。FFPE 组织 RNA 分离使用 High Pure RNA Paraffin 试剂盒(Roche,货号: 03 270 289 001),根据操作手册(福尔马林固定、石蜡包埋组织 RNA 分离方案),从10um FFPET 切片中分离总体细胞 RNA, 经过调整的技术操作步骤如下:1 x 蛋白酶 K 85°C 消化 30 分钟;第二次添加蛋白酶 K 55°C 消化 30 分钟;室温 High Pure 柱上DNase处理 15 分钟。经过调整的技术操作步骤更加快速、上机时间更短,显示其性能具有可比性。
 
RNA 质量控制
使用NanoDrop仪器进行RNA制备物质量与定量分析。使用Agilent生物分析仪与RNA Nano芯片进行某些样本RNA完整性分析。

cDNA合成
使用Transcriptor Universal cDNA Master(Roche,货号:05 893 151 001)与 1ug 总体RNA进行cDNA合成。每份样本均建立3份独立的40µl反应液。逆转录系列RNA稀释液,并分别进行浓缩产物PCR。

实时qPCR
进行 1g 总 RNA 3 份cDNA合成反应混合液、稀释处理,并将其作为模板,用于RealTime ready Custom Panel Plate, 384(Roche,货号:05 582 873 001)。使用LightCycler® 480 Probes Master(Roche,货号:04 707 494 001)进行含有RNA的反应混合物制备。
每孔总体PCR反应容积是10 µl,终RNA容量是10ng。罗氏公司为每个仪器配备有LightCycler® 480 软件,版本1.5,以及content.txt文件,从而使样本设置与结果分析更加容易。
 
结果与讨论
 
NF-kB RealTime ready Custom Panel体外细胞系研究筛选出35种差异表达基因。
为生成首个预测性与药效学标志物假设,我们使用一种多参数panel(92 种靶序列与 4 种看家基因),该panel涵盖有 NF-kB途径,以及广泛的基因表达筛查方法。使用该panel是为建立高通量工作流程,并使操作更加方便。使用相关复合物处理过的肿瘤细胞系,进行首个体外研究。以MagNA Pure LC  仪器自动 RNA  分离、具有RealTime ready NF-kB定制型多孔检测板的、384-孔格式的LightCycler® 480 仪器 RT-qPCR与cDNA合成为起点,使工作流更加便利、快速,并进行相关基因表达分析。
 

工作流描述:NF-κB RealTime ready 定制型多孔检测板体外研究

http://www.uniklinik-freiburg.de/augenklinik/live/homede/Angiogenese/amd.html?raw=true&layout=weiss&szsrc=

 
靶基因表达标准化参考基因选择
对于相关定量分析来说,通过参考基因表达进行靶基因表达标准化。理想情况下,标准化处理应该能够补偿 RNA/cDNA起始量变异情况,以及cDNA合成或 PCR 扩增中潜在抑制剂的作用。参考基因作为内源性样本材料对照,工作流中,与靶基因一同被处理。为获取可靠结果,标准化中选择合适的参考基因非常重要。合适参考基因即:在感兴趣的样本中,性能比较稳定的、非表达调节基因(4,5)。如图 1,于 4 个参考基因中选择出 2 个基因作为参考基因。
 
图 1:9 种细胞系 4 种参考基因表达分析。
本研究 9 种细胞系 4 种参考基因绝对Cq值(重复检测)作图。使用同样cDNA混合液进行PCR。分析
显示,两个参考基因模式相似,参考基因为:ALAS1 (氨基酮戊酸盐、Δ-、合成酶 1)与 HPRT(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 1)。第 3  个基因:MRPL19(线粒体核糖体蛋白 L19)性能非常具有可比性,第 4 个基因:G6PDH(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶),具有独特模式。因此,我们将 ALAS1 与 HPRT 作为参考基因,进行相关基因表达分析。
 
差异基因表达结果
各种实体肿瘤 9 种细胞系 NF-kB panel与 RNA 基因表达分析中,通过Cq值标准化处理,以及联合使用 2 个参考基因(RG),确认出 35 个差异表达基因。Δ Cq计算如下:Cq_RG – Cq_靶值,Cq_RG是参考基因:ALAS 与 HPRT Cq均值。9 种细胞系 TWEAK 受体(Fn14)差异表达模式见图 2
体内移植片研究对RealTime ready NF-kB定制型多孔检测板体外确认的潜在药效学标志物进行确认
应用治疗复合物后,药效学生物标志物(功能性生物标志物)会发生改变,并显示治疗反应(6)。确定治疗复合物相关剂量非常重要。参数选择后,使用体内小鼠模型,对体外确定的假设生物标志物进行验证。使用移植物来源的新鲜冻存(FF)组织样本对所选生物标志物进行检测。图4显示相关安慰剂对照的抗- TWEAK  处理移植物小鼠潜在药效学生物标志物相关基因表达比率。研究发现,用药后,基因表达降低。
图 2:9 种细胞系TWEAK受体基因表达。
相关比率(log 2 量表)计算如下:ΔCq = Cq_HK – Cq_Fn14。以细胞系与时
间点作图。进行 ALAS1 与 HPRT1 标准化处理。
ACHN:人肾细胞腺癌
Caki:人肾透明细胞癌细胞系
SJSA:人骨肉瘤;多源肉瘤
PANC-1:人胰腺癌;上皮样细胞系
MDA-MB 231:人乳腺癌模型;乳房;乳腺;胸腔积液
AsPC-1:人胰腺腺癌
SK-MES-1: 人肺癌
NCI-H322M: 细支气管肺泡腺癌
22RV1: 人前列腺癌移植片细胞系
 
通过RealTime ready NF-kB定制型多孔检测板体外肿瘤细胞系与体内移植物研究,可发现潜在反应性预测标志物。
反应性预测(临床反应)生物标志物可显示:个体对治疗性复合物是否会产生最佳反应性(6)。著名事例:HER2/neu与Herceptin。
确认潜在反应性预测生物标志物,所选9种细胞系相关基因表达(参见图 2)与小鼠模型移植肿瘤生长抑制之间具有相关性。1或24小时收集的细胞系为未处理细胞系,使用抗-TWEAK进行小鼠处理。细胞系基因表达结果表明,重现性非常高,处理时间或培养对表达结果无影响。小鼠模型肿瘤生长抑制(TGI)与细胞系潜在生物标志物相关基因表达之间相关性较高,见图3。
图 3:细胞系中反应性预测生物标志物 1 基因表达与体内肿瘤生长抑制(TGI)结果之间相关性较高。
RealTime ready NF-κB 定制型多孔检测板中基因表达结果与体内 TGI 作图。“生物标志物1”基因表达增加与 TGI 具有相关性。
 

图 4:体内小鼠移植片模型中,抗- TWEAK 治疗反应与潜在生物标志物 2 相关基因表达比率作图。log 2 量表(n = 5 只动物)基因表达中值作图。

 
FFPET 样本特异性RealTime ready qPCR检测潜在生物标志物假设检验
我们使用的第一套临床样本来自于各种用于人类研究的福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织。肿瘤来源的 FFPE  组织是临床试验或生物标志物研究中,治疗复合物研发最具有相关性的样本材料。使用 High Pure RNA Paraffin 试剂盒,从 FFPE 组织(例如:10um切片)中提取RNA,修订操作方案见“材料与方法”
章节的描述,其后是特异性优化与功能学检测RealTime ready RT-qPCR分析。
由于福尔马林固定,以及保存条件的原因,FFPET样本分离RNA呈片段状(7)。对于FFPET来源的RNA来说,为提高灵敏性与重现性,使用长度小于100bp的小片段扩增子非常重要。RealTime ready  检测专用于小片段扩增子的扩增。所有扩增参数均应是RNA特异性,无人类基因组DNA污染。可通过引物探针设计来避免污染,引物探针序列可跨越外显子-内含子交界区。假基因应该是无法扩增的,但并不是所有假基因均已知,或已被发表,必须在对照反应中,使用人类基因组DNA进行假基因检查。RealTime ready 专用于各种 FFPE 来源的,用于人类研究的肿瘤样本(例如:BC、CRC)的分离 RNA  检测,并受到各种 FFPE 来源用于人类研究的肿瘤样本分离RNA检测的检验。根据以下参数,进行最佳RealTime ready RT-qPCR检测选择:灵敏性、线性度、重现性与特异性。根据所感兴趣组织中参数表达级别,cDNA合成所用特异性引物灵敏性应该更高(参见图 5)。

A) 生物标志物 3/肾随机引物

B) 生物标志物 3/FFPET BC随机引物

C) 生物标志物 3/FFPET BC特异性引物

图 5:潜在“生物标志物 3”RealTime ready qRT-PCR 扩增曲线。来自肾 RNA(A)与 FFPE 乳腺癌(BC)样本(B 与 C)系列稀释 RNA 模板。使用 250 ng,最低含量 0.4 ng 1:5 稀释的 PCR 反应混合物(A 与 B),或 100 ng,最低含量 0.16 ng 1:5 稀释的 PCR 反应混合物(C)进行 PCR 启动。C中,使用特异性引物而不是随机引物进行cDNA合成启动,以提高灵敏性。

 
Cq值见表 1。

结论
使用体内以及体外模型,假设生成生物标志物研究中,以及人
FFPE研究样本假设检验中,可成功应用RealTime ready RT-qPCR
检测。已经确立并对不同样本工作流程方案进行描述。使用
High Pure RNA Paraffin试剂盒,可从FFPE组织样本中分离出RNA,
通过RealTime ready检测,可进行qRT-PCR分析。
 
参考文献
1. NIH Biomarker Definitions Working Group,  Clin Pharmacol Ter 2001; 69: 89–95.
2. Winkles, J. A. (2008) Nature Reviews, Drug Discovery 7(5): 411–25. 
3.  RDR report # 1042689 (Draft vers. April 2011)
4.  Bustin, S.A., et al. (2009) Clin Chem 55 (4): 611.
5.  Vandesompele, J. et. al. (2002) Genome biology 3 (7)
6.  de Koning, P. & Keirns, J. (2009) Biomarkers Med 3(6):  685–700.
7. Masuda, N., et al. (1999) Nucleic Acids Research 27 (22):  4436–43.
 
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LIGHTCYCLER、MAGNA PURE、HIGH PURE与REALTIME READY是罗氏公司注册商标。
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