通过我们的高通量 ORF 克隆服务，Invitrogen 为您提供使用 Gateway® 技术的机会，这是一种基于 λ 噬菌体重组的蛋白质表达和分析通用系统。 Gateway® 技术可在不同载体间转移 DNA，而不需要费时的亚克隆步骤。 一旦将基因转入 Gateway® 入门克隆，即可按照需要的转入方向及阅读框，将基因便捷地转移到一个或多个载体中。 提供一个全长 cDNA 序列，我们的科学家将为您扩增开放阅读框，并继而将 PCR 产物克隆到 Gateway® 入门载体中。 然后您可将 ORF 转入任何 Gateway® 表达载体。 在进行基因功能分析时，全长基因的 5´ 和 3´ 非翻译区会干扰最佳的蛋白质表达，而 ORF 克隆在这种情况下特别有用。
高通量 ORF 克隆服务
- 制备。 我们将会再次查验用户所提供的核苷酸序列，以证实其是完整的开放阅读框 （ORF） 序列。 引物设计位于起始密码子 (ATG) 和终止密码子的两侧。 如果是需要形成 C 端融合蛋白，则不加终止密码子，只扩增开放阅读框（图 1）。
- 扩增。 以质粒为模板、PCR时选用低循环数、高保真地扩增所需的 ORF。
- 筛选。 如果没有合适的质粒作为模板，我们将从 Invitrogen 的全长 cDNA 文库中进行筛选。
- 克隆。 我们的科学家会将扩增的开放阅读框克隆到 Gateway® 入门载体，并且将 DNA 转化到化学感受态 E. coli 中（图 2）。
- 测序。 5' 和 3' 端都分别进行测序，以证实扩增到的是正确的靶序列并且具有正确的读码框。
- 验证。 筛选具有抗生素抗性的菌落，以确认所得到的是入门克隆。
- 导入。 客户收到的经证实的入门克隆保存于甘油中。 可将入门克隆转移到一个或多个 Gateway® 目的载体中，以生成适合在相应表达系统中立即应用的表达克隆
在 Invitrogen™ 全长 cDNA 文库中表达的典型全长基因。 基因被克隆到 pCMV•Sport 6.1 载体后，其两侧为 attB1 和 attB2 Gateway® 重组位点。 基因由一个开放阅读框组成，示为起始蛋氨酸 (ATG) 和终止密码子之间的区域。 开放阅读框为基因中编码功能蛋白的部分。 开放阅读框两侧为 5´ 和 3´ 非翻译区，其中包含与调控、转录和翻译后修饰之类功能相关的基序。
图 2. 基于 PCR 的 ORF 克隆
使用包含 attB1 和 attB2 重组位点的基因特异性引物扩增 ORF。 所得的扩增子可在 BP 反应中与 attP 供体载体 (pDONR™) 重组来生成入门克隆。 包含在入门克隆中的 ORF 两侧为 attL 位点，ORF 随后可与任何 Gateway® 目的载体重组来生成表达克隆，后者继而可用于功能研究。
