透射电镜（TEM）

概念
透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,简称TEM),可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2um的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率
原理
透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）是利用阴极发射的电子，通过阳极中央的微孔形成的电子束穿透样品获得样品的电子信号，经物镜、中间镜和投影镜等多级电子放大至数百至数千万倍，最后成像在荧光屏上便可即时观察，或是投射到照相底片感光片上作为永久记录。目前TEM的分辨力可达0.2 nm。
由于标本必须置于高真空中进行电镜观察，所以电镜观察的生物标本必须特殊制备，不能含水，离体的生物标本要迅速加以固定，以防产生结构改变。另外，电子的穿透力很弱，这就需要把样品制成50 nm～100 nm厚的超薄切片（一个细胞切成100～200片）。为了使柔软的生物组织能够制成这样薄的切片，并使切片耐受高真空和电子轰击，所以在切片前要进行包埋。超薄切片技术是透射电镜观察成功的关键。
实验流程
取材及戊二醛固定→漂洗→锇酸固定→漂洗→丙酮梯度脱水→渗透→包埋→切片→双染色→电镜观察及拍照
实验结果
 
注意事项

• 取材

• 快：实验标本在动物麻醉或处死后1~2分钟内取材、固定完毕；临床活检标本力争组织离体后1分钟内固定。固定液为预冷的2.5%缓冲戊二醛固定液。
• 小：电镜标本的标准大小为1mm3。取材时，可先取稍大组织，经稍许时间的预固定后，再改小。
• 利：切割组织时，需用锋利的手术刀片、双面刀片划取，避免揉割、牵拉和挤压组织，防止机械损伤。禁止使用剪刀剪切。
• 净：取材所用器皿，应事先清洗干净并烘干。
• 冷：取材可在常温下进行。如有条件最好在4℃低温下操作，以减少组织自溶。所用器械、容器及固定液均应预冷。
• 所取标本做好标记：瓶签上注明组别、编号等。
• 取材部位应准确：根据观察内容和实验目的，精准取材，如肿瘤取材时，应确保取到肿瘤实质，避免取肿瘤间质或出血、坏死部位。

 

• 固定

预固定：2.5%缓冲戊二醛固定液，用量应为10~20倍于组织块的体积，4℃固定至少30min以上。
取适量0.1mol/L PBS缓冲液清洗3次，每次10min。
后固定：1%锇酸固定，肾脏固定4min，其他组织固定1h。
取适量0.1mol/L PBS缓冲液清洗3次，每次10min。
 
 
 

• 培养细胞的取材和固定细胞样本做透射电镜处理办法与保存条件
  1．常规收集帖壁和悬浮细胞，置离心管中离心，800～1000r/min，10min。
  2．用0.01mol/L PBS 5ml重悬细胞。
  3．将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。
  4．离心，2000r/min，15～20min，使细胞成团。
  5．小心吸去上清，加入2.5％戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。
  6．取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。
  7．将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中，4℃（可长期）保存。
  8．用0.1mol/L PBS缓冲液洗1次。
  9．1％锇酸后固定30～60min。

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