动物实验平台——基因型鉴定

基因型(genotype)是指一个生物体内细胞 DNA所包含的与某个性状相关的基因类型。主要通过PCR和Southern blotting分析来鉴定基因修饰动物的基因型。PCR反应为常规方法，转基因动物有时需要用Southern blotting验证转基因拷贝数。用Southern blotting还可以确定转基因是否发生重排或删除。基因发生重排时，会导致酶切位点发生变化，产生不同的酶切图谱。用实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)可快速确定转基因mRNA表达量。

转基因随机插入动物基因组，如果转基因动物没有异常，通常不需要确定转基因整合位置；如需测定，可以通过荧光原位杂交在显微镜下直接观察整合位置和局部染色体结构。这项技术还可以用于检测转基因插入部位的染色体重排以及由Cre重组酶诱导的局部染色体删除。

PCR反应基因型鉴定的原理是首先设计能与引入的外源基因结合的特异性引物，扩增原本不存在于动物基因组中的DNA序列。引物的设计很关键，转基因动物基因型分析的引物通常位于转基因内，一般选择特异性的DNA序列作为引物以确定转基因是否存在。在多数情况下，转基因的插入位点是未知的，难以设计引物以确定转基因是否为纯合子或杂合子。

对于基因敲除和基因敲入动物，由于明确知道基因修饰的位置，因此，可以设计野生型和突变型的引物以确定基因型是否为纯合子或杂合子。突变型引物对：一个引物位于同源重组短臂外；另一个位于引入的外源基因，如Neo基因内。野生型引物通常位于要敲除的DNA序列。突变型和野生型PCR产物的大小应不同，在100～700bp之间，足以用凝胶电泳区别鉴定。引物的GC比例约为50％(40％～60％)。基因型分析时还要注意设立对照组。PCR反应阳性对照：可选内源性看家基因如β-actin，以确定DNA质量和正确的扩增反应体系。每个DNA样本的PCR反应都应为阳性。阴性对照：通常指用水代替DNA模板的对照组，以排除污染和假阳性。

实验过程：提取基因修饰动物的DNA、用PCR反应扩增靶序列、琼脂糖凝胶电泳、检测DNA片段的有无和大小以确定基因型。从活体组织中分离基因组DNA，小鼠的活体解剖组织可以是一小片尾或耳组织。转基因小鼠的基因型鉴定可以只用一对特异性引物进行分析，结果为阳性(+)或阴性(-)：阳性表示有转基因，阴性表示没有转基因。基因敲除或基因敲入小鼠的基因型鉴定通常需要设计两对引物。一对引物扩增野生型，另一对引物扩增突变型。基因型鉴定结果有三种情况：野生型用+表示，突变型用-表示。+/-为基因敲除杂合子，+/+为野生型小鼠，-/-为基因敲除纯合子。

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