Western Blot检测（免疫印迹检测）

 通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
操作方法：
      一蛋白质样品获得:细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

二电泳:制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。

三转移:(半干式转移)

1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。

3、转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

四免疫反应:

1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。

3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。

5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。

6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。

7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

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