Western Blot检测

Western Blot检测： 
蛋白印迹（Western Blot）是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法，用于检测经电泳或斑点杂交后固定于膜上的蛋白质的检测。特异、稳定的液态酶标抗体和相应的底物，保证了快速、准确的检测；而避免了放射性物质的使用，现已成为蛋白分析的一种常规技术，对蛋白进行定性和半定量分析。

科佰生物团队有丰富的WB经验，成功完成了各种蛋白的检测，除了传统的流程外，公司也掌握了快速转膜法（一天完成WB），红外二抗检测（Oddssey）等技术。

实验流程：
1.蛋白质抽提

  实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。

  实验对象为细胞样品，每份样品取1×10⁶～1×10⁷细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE):将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。

4. 蛋白质转移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，300mA恒流条件下，4°C转移90分钟左右。

5. western blot膜的封闭和抗体孵育。

  膜在5％脱脂奶粉(磷酸化蛋白用BSA)溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。

  封闭过的膜加入一抗4°C孵育过夜，抗原抗体结合。

  加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。

6. western blot结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。

  当加入的二抗选择外红荧光二抗时，用Oddssey曝光条带。

7. western blot数据分析，可定性、半定量分析。

8. 提供实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关数据。

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7.数据统计与分析
8.论文翻译与润色
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