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siRNA干扰
天津赛尔生物的siRNA干扰服务由参与主编《RNA干扰：原理与应用》的工作人员，可以根据客户的需求，提供从siRNA设计到合成，shRNA质粒的构建，转染，病毒包装siRNA，RT-PCR及WB验证的一站式服务，让RNA干扰不再干扰您的科研。 技术背景： RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。 2：基于化学合成的双链siRNA，基于载体的shRNA构建，病毒系统包括慢病毒( lentiviral ) 、逆转录病毒( retroviral ) 和腺病毒 ( adenoviral ) 包装siRNA 3：体外通过转染或感染的方式导入siRNA 4：RT-PCR，WB检测干扰效果 交付内容 1：siRNA序列 2：采用质粒转染方式的，交付构建好的shRNA质粒。采用病毒系统包装siRNA的，交付含有包装shRNA序列的重组病毒。 3：RT-PCR，WB检测结果。赛尔承诺，对于一些非公开siRNA序列基因的siRNA设计的干扰效果，三条序列中至少有一条干扰效果在75%以上 4：详尽的操作步骤及实验结果 常见问题及解答 问1：怎样设计siRNA序列？ 答 siRNA序列的设计一般遵照以下的步骤和原则 1． 在所选基因的启动子后 50-100个碱基自5’-端开始 2． 寻找基因序列中的23个碱基， 最好是5‘- AA（N19）TT -3’ （N是任何碱基） 3． 如果找不到四个以上AA（N19）TT，则用 AA（N21）补足。 4． 如果找不到四个以上AA（N21）， 则用 NA（N21）补足。 5． 所选定序列中，G和C的数目的总和在总数（23）的35-55%. 6． 满足以上1-5项要求的片段数目如果不足四个，将G和C的数目的总和放宽至总数（23）的30-70%. 7． 选好上述序列后，以此确定所需合成双链RNA oligo 的序列如下： 8． 正义序列 （N19）TT 与上述选定的23 个碱基序列中的第3-23个碱基相同 9． 反义序列的3’----5’ 的序列与目标序列中的第1-21个碱基互补， 即A变成T，C变成G， T变成A， G变成C。 10． 将反义序列3’----5’ 改写成 5’----3’. 11． 将最后所得序列中除3’- 末端的两个碱基之外的所有碱基中的T都用U来替代。 最后每三个组成一个字节，中间断开。 12． 将所选定的正义序列和反义序列与gene bank 中已知同物种的基因序列进行比较，确定其唯一性（BLAST） 13． 上述 7-10 项可见如下例子： 假如通过1-5 项的条件选出的一段23 个碱基的序列是 5’- AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 正义序列就应该是： 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 反义序列就应该是: 3’- TTCGATCAGTACCGGTAACTG -5’ 反转处理后即得： 正义序列： 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 反义序列： 5’- GTCAATGGCCATGACTAGCTT -3’ U替代T以后得到： 正义序列： 5’- GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT - 3’ 反义序列： 5’- GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT -3’ 段开字节后最后得到： 正义序列： 5’- GCU AGU CAU GGC CAU UGA CTT - 3’ 反义序列： 5’- GUC AAU GGC CAU GAC UAG CTT -3’ 赛尔的siRNA专家曾经参与编写《RNA干扰：原理与应用》，在siRNA设计方面非常有经验，成功的为客户设计了数百条siRNA序列。 问2：化学合成siRNA,编码shRNA载体构建生产siRNA，重组病毒导入siRNA, 我该采用哪种方法进行RNA干扰？ 答：化学合成siRNA：操作简便，研究人员得到合成好的siRNA后，进行简单的稀释处理即可实验，但是基因抑制持续时间短，对细胞毒性较大。 编码shRNA载体构建生产siRNA：与化学合成siRNA相比：shRNA载体能够更有效阻遏相应基因的表达，可以用于稳定细胞系的建立，可以持续提供siRNA，携带GFP的载体可以用于检测转染效率。操作相对复杂，需要构建shRNA质粒。 重组病毒包装siRNA: 实验操作相对复杂，对技术要求较高，费用较高，特别适合于一些难转染的细胞系（如原代细胞，干细胞）的siRNA干扰。 所以客户要综合本实验的要求，成本等各个方面选择适合自己实验的RNA干扰方法。 问3：为什么我采用国外文献已经公布并且确定的siRNA序列，通过脂质体转染的方法在我的细胞系中没有得到预期的干扰效果？ 答： 国外文献已经公布并且确定的siRNA序列从序列本身来说应该没有问题，可能的情况是您的细胞系是否适用于常规的转染方法，对于转染效率低于50%的细胞系，我们建议采用重组病毒包装siRNA的方法。所以您首先要通过查阅文献或做一个GFP的对照实验检测一下您细胞的转染效率。 问4：在转染过程中发现细胞死亡，应该怎么处理？ 答： 常规的脂质体转染试剂都会对细胞有一定的毒性，这不用奇怪。按照我们的经验，如果细胞的死亡在30%以下，应该算是正常的。如果细胞的死亡大于60%，在排除其他操作的情况下，您就需要对转染条件进行优化，优化的过程一般包括以下几个方面： 1. 调整转染试剂的浓度； 2. 在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液， 3.调整细胞的生长状态；一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性； 4.调整转染试剂和siRNA的比例 赛尔生物相关服务 MicroRNA siRNA干扰 课题整体外包服务 基因克隆服务 慢病毒包装服务 腺病毒服务 稳定细胞株筛选服务 蛋白表达服务 抗体制备服务 DNA与蛋白相互作用研究 噬菌体展示技术服务 cDNA文库构建 干细胞研究 基金申请，标书撰写，专利申请，课题设计等。
联系咨询我们 地址：天津市津南区小站镇黄台工业园嘉园道8号（华若英） 官网：联系咨询我们 官网：www.saierbio.cn QQ： 2774964243
邮箱：info@saierbio.com 电话：022-66211462-8001 手机：柳先生18622120547
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