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实验案例：
          XX蛋白在CD4+/CD25+调节性T细胞介导的A疾病作用研究
研究方法：
1. 标本采集：受试者于清晨空腹平卧位抽取肘静脉血5ml，注入EDTA抗凝管。
2. CD4+/CD25+ Treg细胞的分选：应用流式细胞仪对CD4+/CD25+调节性T细胞（Treg）进行流式分选。
3. 荧光定量检测Treg中A蛋白及B蛋白mRNA的表达量。研究目的：探讨XX蛋白在A疾病患者与健康人群外周血Treg的差异表达及其表达差异在A疾病发病中的意义。
研究对象：A疾病初诊患者20例为A疾病组（AH），选择健康体检者20例为健康对照组（CN），年龄和性别与A疾病组无统计学差异。

一、人外周血淋巴细胞分离
实验试剂：人淋巴细胞分离液（sigma）;D’hanks液（实验室常备）
分离方法：取5ml新鲜抗凝血，与D’hanks液1:1混匀后，小心加入5ml的细胞分离液之液面上，以1500转/分离心（半径15cm水平转子）15分钟，此时离心管中由上至下细胞分为4层。第一层为血浆或组织匀浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。小心收集第二层细胞，沉淀经反复洗两次即可得到淋巴细胞。用于后续免疫磁珠分离。随机抽取4个样本少量细胞用抗CD4-FITC,CD25-PE标记的抗体流式检测分离前细胞CD4+含量。

二、免疫磁珠方法分选CD4+CD25+Treg细胞及流式鉴定：
原理：免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
实验材料：人外周血淋巴细胞；CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit human（Miltenyi biotec）;MidiMACS分选器（Miltenyi biotec）;LD和MS分选柱（Miltenyi biotec）;Mouse Anti-human CD4-FITC,11-0048,Excite 488 nm（ebioscience）；Mouse Anti-human CD25-PE,12-0259,Excite 488 nm（ebioscience）；Mouse Anti-human FOXP3-APC,17-4777,Excite 633 nm（ebioscience）

CD4+CD25+Treg分选步骤：略
流式鉴定：取1×105个细胞用抗 CD4-FITC、抗CD25-PE的抗体双色标记，室温避光孵育 30 min后用 PBS液洗涤重悬，上流式细胞仪检测分选的 CD4+CD25+T细胞的纯度。另外取1×105个细胞用抗 CD4-FITC、抗CD25-PE的抗体双色标记后，用固定剂和通透剂对其固定打孔后用抗 FOXP3-APC标记的抗体进行胞内因子染色，室温避光孵育 30 min后用 PBS液洗涤重悬，上流式细胞仪检测分选的CD4+CD25+T细胞胞中FOXP3的表达情况。
检测结果：图片显示各个区的检测结果，以CD4荧光强度为横轴，CD25荧光强度为纵轴，划分为4个分区，各区意义如下：
左上区：CD25+细胞区
右上区：CD4+CD25+细胞区
左下区：CD4-CD25-细胞区
右下区：CD4+细胞区

详细实验信息请看以下链接：

http://www.jiamay.net/vshow_28_1871.html

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