热点实验服务：WB,IH,IF,ICC实验服务

WB操作规程

 一．设备和试剂
1．设备
① 电泳电源
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)
② 电泳仪及附件
Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)
③ 电转仪及附件
Mini Teans-Blot Elecreophoresis Transfer Cell (BIO-RAD,Catalog#170- 3930)
④ NC膜
PIERCE，Catalog#88018
⑤ 滤纸
Whatman,3MM CHR

2.试剂
① 凝胶试剂（实验室常备）
 

②Total protein Extraction Kit ，ProMab•美国，Cat. No：SJ-200501 
Renewable Buffer膜再生液，ProMab•美国，Cat. No：SJ-200512
天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK•德国，Cat. No： 444810
天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK•德国，Cat. No：71183-3
Bradford蛋白浓度测定试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：BRAKIT
细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：P1001
细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，嘉美生物•中国，Cat. No：P1003
③ 常用溶液及缓冲液
A．5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml：
ddH2O：1.7ml
30%丙烯酰胺溶液：0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8)：0.315ml
10%SDS：25ul
10%过硫酸铵：25ul
TEMED：3ul
B．分离胶溶液配方参考表
 

C．电泳缓冲液，1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。
D．电泳转移缓冲液,1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、甲醇200ml, 加蒸馏水至1L, 也可以制成10×的储存液，在湿温下长期保存。
E．5×样品缓冲液,10ml
0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Ph6.8）、5ml 50%的甘油、2ml 10%的SDS、0.5ml 2-巯基乙醇、1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。
④ 二抗稀释液
用1%BSA-PBS（含0.05%TWEEN20）稀释。
常用Secondary Antibody ：
Rabbit Anti Goat IgG/HRP,嘉美生物, SEH0103,(1:10,000~40,000)
Goat Anti Rabbit IgG/HRP (SCBT, Catalog# sc-2030,1:10,000~40,000)
Goat Anti Mouse IgG+A+M(H+L)/HRP, ZYMED, #62-64201(1:40,000~100,000)
Goat anti-rat IgG-HRP,SANTA, sc-2032(1:5 000~1:10 000)

二．蛋白提取（根据样品及检测要求选取以下适当提取方法）
A-1．组织裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )
1)．用剪刀剪取约0.5mg组织，置于组织匀浆器中，加入1ml 总蛋白提取液，匀浆5min~20min直到组织充分破碎,然后冰上放置10~20min后，再匀浆5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2)．超声3次，每次3s。
3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中
4)．-20℃冻存。
A-2．组织裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）
1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2)．以下组织的处理应当尽快转移到 4℃无菌器皿中,如结缔组织,脂肪 血管等，最理想的组织应当切成2到3mm的碎块，然后转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4)．组织碎块在100×g 4℃条件下离心2分钟，小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。
5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。
6)．转移适当量的细碎切块 (可能冰冻的) 到一个预冷的匀浆器。 (最好是一个玻璃或石英制品)，向匀浆器中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取组织块。
7)．小心地匀浆组织碎块，可以使用杵磨碎组织细块直到它们成为冰冷的混合体 (例如  牛的肝脏需要10 下) ，尽可能使碎块看不见。需要的用杵磨的次数取决于组织的结构。如果需要提高效率，可以事先使用显微镜观察其结构。目的是为了得到单个细胞，而非对组织进行支离破碎。
8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在4℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。
9)．在16,000 x g和4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到匀浆器中充分混匀,并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟 4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12)．在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。
A-3．组织裂解分离提取浆/核蛋白  (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)
1)．使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。
3)．取约1~20mg适量的冻存组织置于EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4)．将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。
5)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
6)．4℃，16000g离心5min。
7)．移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8)．在絮状沉淀中加入 
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2

9)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
10)．4℃，16000g离心5min。
11)．将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70℃。

B-1．细胞裂解提取总蛋白 (采用Total protein Extraction Kit，ProMab, Cat. No：SJ-200501 )
1)．细胞收集好，加入1ml 总蛋白提取液，充分吹打,然后冰上放置10~20minmin后，再吹5min~20min,将匀浆液吸出放到1.5ml离心管中。
2)．超声3次，每次3s。
3)．9000rpm，离心10min，取适量上清置于新的1.5ml离心管中。
4)．-20℃冻存。
B-2．细胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提试剂盒ProteoExtract™ (M-PEK)，MERCK，Cat. No： 444810）
1)．确定缓冲液充分融解，且被旋涡器充分混合。在抽提过程中缓冲液1和 2 保持在冰上并和蛋白酶抑制剂混合。
2)．将细胞收集好转入一个装有2ml冰冷缓冲液的管中洗涤。
3)．轻轻弹打试管几次冲散血细胞和其它松散物质。
4)．在100×g 4℃条件下离心2分钟， 小心移去上清液且保证没有沉淀丢失。
5)．加入2毫升冰冷缓冲液洗涤，重复步骤3和4洗涤，在最后的洗涤步骤之后，小心完全地除去所有的缓冲液。
6)．向装有洗涤好的细胞的管中加入10ul 蛋白酶抑制剂，并立即加入2毫升冷的缓冲液1 萃取细胞。
7)．小心地吹打细胞，尽可能使细胞看不见。
8)．尽可能完全地转移混合物到一支预冷的管中并在 4 ℃ 轻柔的摇动10分钟。推荐使用旋转式振动器可以避免细胞结团的形成。
9)．在16,000 x g和 4 ℃ 15 min条件下分离不能溶解的材料。
10)．丢弃上清液(丰富的“可溶性”蛋白质，此蛋白溶液 可用于内参检测)或使用吸移管转移它到样品管，无需干扰底层细胞。切记分离所有液体。 如果需要应当保留成数份冰冻以便以后分析。
11)．放入5ul蛋白酶抑制剂到管中充分混匀，并立即加入1毫升冰冷缓冲液2萃取细胞团.，使用吸移管仔细地完全地重悬细胞团。在30分钟  4 ℃条件下轻柔的摇动。 推荐一台旋转式振动器避免细胞团的形成。
12)．在16,000 x g和 4℃ 15 min条件下 分离不能溶解的材料。
13)．使用吸移管完全转移上层清液(包括丰富的膜相关蛋白质)到样品管，无需吸入细胞残渣。

B-3．细胞裂解分离提取浆/核蛋白  (采用天然浆/核蛋白分离抽提试剂盒NucBuster TM Protein Exaction Kit ，MERCK，Cat. No：71183-3)
1)．使用前浆冷冻的Protease Inhibitor Coctail Set 1 溶于100ul 灭菌水配成100 ×体积，分装冻存于-20度(1~3×107细胞用1ul/100×)。
2)．所有蛋白体提取过程应在冰面上操作，保持蛋白的稳定性。
3)．将细胞收集好在EP管中，加入液氮使用EP管研磨杵快速研磨成粉末。
4)．将适量粉末转移至预冷的1.5ml EP管中，加入150ul NucBuster Reagent 1。
5)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
6)．4℃，16000g离心5min。
7)．移除上清液(为胞浆蛋白成分，可用于内参检测)，胞浆蛋白可以保存他用或者丢弃，再用500ul预冷的1×PBS再洗一次去除多余的胞浆蛋白。
8)．在絮状沉淀中加入  
1ul 100×Protease Inhibitor Coctail
1ul 100mM DTT
75ul NucBuster Exaction Reagent 2

9)．高速漩涡振动15S，冰面孵育5min，再次高速漩涡振动15S。
10)．4℃，16000g离心5min。
11)．将上清液(核蛋白)转移至另一管，可立即使用或分装保存于-70℃。

线粒体蛋白提取见附录1

详细操作请见以下链接：

www.jiamay.net/vshow_28_2020.html

• 热点实验服务：酪蛋白酶谱法MMP3/7/10检测实验服务
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