基于iTRAQ的定量蛋白质组学分析

技术简介

      研究不同生理病理条件下组织内蛋白质的表达水平的变化是比较蛋白质组学的核心内容。要揭示上述动态过程往往需要进行多个样本的同步比较分析。近年来，在体内和体外稳定同位素标记基础上，用多维相色谱分离多肽，进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一。

       iTRAQ（isobarictags for relative and absolute quantitation）技术是由美国AB Seiex公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用多达8种稳定同位素标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较多达8种不同样品中蛋白质的相对含量。

技术优点

  l  iTRAQ标记技术可在一次实验同时对多达8个样本进行定量分析，降低了反复实验引入的技术误差，8个样品之间可进行任意两两比较，增加实验设计的灵活性。可用于多个时间点蛋白质组动态变化的监测、；灵活增加实验重复/技术重复以及进行多个个体样本的研究。

  l  该技术为体外标记，可标记各种动物组织、植物组织、微生物、体液、细胞等样本。

  l  重复性好，灵敏度高，蛋白覆盖范围广，在单张谱图中同时进行定性与定量。

  l  标记完全，标记效率高达97%以上，等质量的同位素标签不增加样品的复杂程度。

  l  一次实验可定量3000-5000种蛋白(2个unique peptides以上)。

技术原理

  l  iTRAQ试剂由三部分组成：1）报告基团（reportergroup）相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121Da；2）平衡基团（balance group）相对分子质量分别为192、191、190、189、187、186和184 Da； 3）反应基团（peptide reactive group）形成8种分子量为305 Da的等质量同位素标签。

  l  iTRAQ试剂标记酶解后的肽段，可与氨基酸N端及侧链的一级胺发生反应。在一级谱图中，来自于不用样品的同一肽段，标记后，表现为相同的质荷比。

  l  在二级质谱中，报告基团、平衡基团和反应基团之间的键断裂，带不同同位素标签的同一肽段产生质量为113、114、115、116、117、118、119和121Da的报告离子，根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

实验流程

送样标准

l  动物组织的样品量湿重不少于200mg。

l  植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2g。

l  富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5g；如植物的根，木质部、韧皮部组织等。

l  体液类（唾液、羊水、脑脊液等）10ml以上，要保证不能溶血；血清要求500ul以上；尿液要求50ml以上。

l  如直接提供蛋白质提取物，浓度不少于2mg/ml，总量不少于1mg。为保证实验效果，请尽量告知缓冲液成分，如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。

l  在细胞器蛋白质组学方面，提取细胞器或亚细胞器的工作在原则上不予处理，由客户自行提取后送样，蛋白沉淀量在1mg以上；特殊情况可与商务人员具体商议。

杭州景杰生物科技有限公司（PTMBiolabs,Inc.）是一家成立于2010年的创新型高新技术企业，座落于风景秀丽的钱塘江畔，是杭州市大力引进的海外高层次留学归国创业企业。公司现有员工50余人，其中具有海外名校留学背景的博士博士后10人，本科以上科技人员占90%以上。


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人类基因组的解码开创了以基因解析为特征的个体化医学新时代。然而，基因型与疾病表型的不相关性揭示出个体化医学的本质在于疾病最相关的功能分子----蛋白质。蛋白质修饰（ProteinPost-translationalModification,PTM）是蛋白质行使功能的最高级形态，是表观遗传现象的核心内容。因此，以蛋白质修饰-表观遗传为特征的生物医学研究是个体化医学领域的最前沿。

蛋白质修饰与表观遗传学是生物医学最前沿的研究领域，是21世纪生命科学与生物技术产业化的战略前沿和主要突破口。不久前，国际人类蛋白质组组织宣布全面启动“国际人类蛋白质组计划（HPP）”，其实施势必全面带动科学技术及生物产业的发展。在国际上，以蛋白质修饰与表观遗传为特征的靶向性抗肿瘤药物开发是个体化医学的核心内容，是跨国制药公司与著名药物研发中心争相投入的领域。

个体化医学和蛋白质组学是我国重点支持的科学研究与科技产业发展方向，2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006—2020）》明确宣示在国家政策层面上重点支持个体化医学和蛋白质组学研究与产业化转化。2011年科技部《关于印发医学科技发展“十二五”规划的通知》（国科发计[2011]552号）明确指出蛋白质组学技术和个体化诊疗技术为“十二五”发展重点。中国健康促进基金会和国家发改委等五部委也先后启动了个体化医学专项资助项目（中国健康促进基金会[2011]002号）和蛋白类生物药和疫苗发展专项（发改办高技[2012]3420号）。