RNA-Seq全面解决方案

转录组指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合。转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。RNA-Seq能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），是获取转录组情况的有效高通量试验方法，它不仅可以获取de novo的转录本，同时可以检测转录本的绝对表达量和差异表达分析（针对不同处理组或时间序列的试验设计）。

一、技术路线和方法：

二、生物信息学分析
2.1 基本数据分析
Part01：基因组定位及统计
过滤低质量序列，一般将质量低于20的替换为N。然后使用MAQ、bowtie等Mapping软件将序列定位到基因组上，统计Reads在基因组上的定位信息。
Part02：转录本表达量计算
RNA-Seq可以得到远多于基因芯片的RNA数据以及拥有发现新转录本能力。大量的Reads可以定位到同一个ORF，而且Reads的覆盖度和RNA在细胞中的丰度具有相关性。统计单个ORF的Reads覆盖度可以得到此ORF的相对表达量。
Part03：基因表达量差异分析
Part04：（差异）基因GO分类
Part05：（差异）基因Pathway分类
2.2 高级数据分析
Part06：可变剪切预测
我们使用TopHat（Cole Trapnell et al. 2009）软件进行可变剪切的预测分析。
Part07：新转录本预测
Part08：反义转录本预测
Part09：SNP、Indel和Mutation变异体注释
为了获取较为准确的SNP、Indel和Mutation数据，通过变异过滤系统进行过滤, 主要的过滤策略为:

• 去除在某一位点上reads覆盖度过低(<20×)或者过高(>5000×)的SNP。
• 每一个非参考等位位点上的独立的reads必需大于3（同一个克隆的reads的起始位点相同）。
• 每一个非参考等位位点至少有20%的覆盖度。
• 统计SNP、Indel和Mutation在基因组上分布。
• 根据分布计算得到的新SNP、Indel和Mutation的可信度。

Part10 ：基因调控网络构建
Part11 ：蛋白互作网络构建

三、测序平台