酵母表达系统

·酵母表达系统——步骤1. 目标基因亚克隆至酵母表达载体：
扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。
将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。
测序验证构建质粒的准确性。
可提供表达载体：pPICZα和pPIC9K
提供客户：正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
服务周期：1周

·酵母表达系统——步骤2. P. Pichia表达菌株电转化：
酶切线性化表达质粒。
将表达质粒通过电转化到高效的P. Pichia表达菌株中。
利用蛋白酶去除不需要的纯化标签（Tag），再纯化获得所需的目标蛋白（可选，构建表达载体时需加入合适的蛋白酶切位点）。
通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆。
可提供表达菌株：X33，GS115，KM71和SMD1168。
提供客户：PCR阳性克隆及PCR结果报告。
时间：1周

· 酵母表达系统——步骤3. P. Pichia表达菌株筛选：
将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目标蛋白。
SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。
如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍作用再检测，或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达（客户需要提供相关抗体）。
提供客户：任意一个客户需要的阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。
时间：2周

·酵母表达系统——步骤4. P. Pichia表达菌株表达优化：
挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达最好菌株优化表达条件。
对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基，菌体密度，甲醇浓度，诱导时间等），提高目标蛋白的表达量。
提供客户：任意三个客户需要的阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。
时间：2周

·酵母表达系统——步骤5.目标蛋白表达及纯化：
摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目标蛋白。
通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
提供客户：纯化好的目标蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白，纯度最高可达90%以上。
时间：2~3周

备注：
1. 如果没有获得目标蛋白，则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品，则双方协商本步骤费用（给予客户20%~50%折扣）。
2. 如果客户需要详细的纯化工艺，包括详细纯化条件及每步结果，则需要加收100%相应费用。
3. 因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同，我们最终根据实际情况将给客户提供最少1mg，最多10mg的目标蛋白，所收取的费用是相同的。
4. 我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液（Tris-HCl，PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液）中蛋白质溶液，并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统，所以我们无法保证最终产品的生物学活性，不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。 如果客户一定要求目标蛋白活性，我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格，我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30% ，而如果样品活性合格，我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。
5. 每次Western-blot检测最多7个样品，因为要加入阳性对照，阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测，如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗，如果客户需要使用其他一抗，则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响，因此我们并不能确保检测结果（可能会出现假阳性或是假阴性的结果）。如果结果不正常，我们可以免费重做一次。

·酵母表达系统——步骤6.目标蛋白的再加工及详细检测
对生物学活性要求较高的纯化后蛋白产品进行复性研究。
内毒素去除，除菌，冻干等进一步加工。
通过HPLC，质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。
服务内容：
1.复性研究：
利用多达18种不同复性缓冲液的体系，对目标蛋白进行小量复性试验提供复性后样品供客户检测。
可根据客户要求，按照其中一种样品的复性条件制备小量的复性蛋白。
可提供具体的复性缓冲液配方及复性工艺。
2.除内毒素
3.过滤除菌
4.冻干
5.HPLC检测
6.质谱检测
提供客户：加工后的终产品及相关实验和检测报告。
时间：1~2周
 

·酵母表达系统——步骤7. 大规模制备
提供客户：合格的目标蛋白及服务报告。。
时间： 协商
 

·订购信息：
邮箱：info@sinobio.net
电话：021-50798028
传真：021-50798028-13

  近岸蛋白质科技有限公司(前身上海欣百诺生物)是一家专门从事重组蛋白质领域研发外包的高技术服务企业，为国内外客户提供生物活性酶、细胞因子等各种重组蛋白质表达、纯化服务及工艺开发。 

  近岸总公司位于太湖之滨的吴江科技创业园，在吴江建立了重组蛋白质生产基地，在上海张江开发区建立了现代化的蛋白质研究中心，是上海市首批技术先进型服务企业，通过ISO9001:2008国际质量管理体系认证。主要客户来自全球16个国家和地区，包括6家全球前10位的制药企业、数百家其他企业与科研机构，公司产品及服务已被数十篇SCI学术论文引用。

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