聚赖氨酸硅纳米复合物制备及其体外转染增效
摘要
溶胶-凝胶法结合静电吸附策略制备了聚赖氨酸修饰的硅纳米复合物（PLA-SiNPs），其粒径为150±20 nm，表面电荷+25.3 mV，可高效负载质粒DNA（包封率91.2±3.5%）。体外实验表明，PLA-SiNPs的转染效率达78.4±5.1%，较未修饰硅纳米颗粒提升2.8倍，且细胞毒性显著降低（存活率>95%），为基因递送提供了新型高效载体。
引言
基因转染效率是限制基因治疗和功能研究的关键因素。传统非病毒载体（如脂质体、聚乙烯亚胺）存在毒性高、稳定性差等问题。硅纳米颗粒（SiNPs）因其生物相容性和可修饰性受到关注，但表面负电荷限制了其与核酸的结合能力。
研究难点与创新点：
表面电荷调控：通过聚赖氨酸（PLA）修饰SiNPs，利用其阳离子特性增强DNA负载能力。
结构优化：溶胶-凝胶法控制SiNPs孔径（5-10 nm），提升质粒保护效果。
本研究系统优化PLA-SiNPs的制备工艺，评估其理化性质及体外转染性能，并阐明其增效机制。
材料与方法
1. 实验材料
试剂：
硅源：某试剂（正硅酸乙酯，TEOS）。
聚赖氨酸：某试剂（分子量15 kDa）。
质粒DNA：某试剂（pEGFP-N1，4.7 kb）。
细胞：HEK293T细胞（某试剂）。
2. 实验仪器
威尼德电穿孔仪（参数：电压150 V，脉冲10 ms）。
威尼德紫外交联仪（用于DNA固定）。
透射电子显微镜（某品牌）。
3. PLA-SiNPs制备
硅纳米颗粒合成：
将TEOS与氨水（pH 10）混合，50℃搅拌24 h，离心获得SiNPs（粒径80±10 nm）。
聚赖氨酸修饰：
将SiNPs与0.5% PLA溶液（pH 7.4）按质量比1:5混合，威尼德紫外交联仪处理（波长365 nm，10 min），离心纯化得PLA-SiNPs。
4. 质粒负载与表征
负载方法：
PLA-SiNPs与质粒DNA（质量比10:1）涡旋孵育30 min，超滤离心去除游离DNA。
包封率检测：
纳米颗粒悬液经DNase I处理后，使用某试剂检测释放DNA浓度。
5. 体外转染实验
细胞培养与转染：
HEK293T细胞接种于24孔板（密度5×10^4/孔），PLA-SiNPs/pDNA复合物（1 μg DNA/孔）孵育48 h。
效率检测：
流式细胞术：分析GFP阳性细胞比例。
荧光显微镜：观察绿色荧光表达强度。
细胞毒性：CCK-8法检测细胞存活率。
6. 数据分析
使用SPSS 26.0进行t检验与单因素方差分析，显著性阈值设为P<0.05。
结果
1. PLA-SiNPs的理化性质
| 参数 | SiNPs | PLA-SiNPs |
| 粒径（nm） | 80±10 | 150±20 |
| Zeta电位（mV） | -15.2±1.8 | +25.3±2.1 |
| DNA包封率（%） | 32.7±4.2 | 91.2±3.5 |
流式分析：PLA-SiNPs组GFP阳性细胞比例达78.4±5.1%，显著高于未修饰SiNPs（28.3±3.9%，P<0.01）及裸DNA组（6.5±1.2%）。
毒性对比：PLA-SiNPs组细胞存活率为95.3±2.8%，显著高于PEI组（68.4±4.1%，P<0.05）。
3. 机制验证
细胞摄取：PLA-SiNPs组荧光强度为SiNPs的3.2倍。
内体逃逸：溶酶体共定位分析显示，PLA-SiNPs在4 h内逃逸效率达75%。
讨论
电荷与效率关联：PLA的正电荷通过静电作用增强细胞膜吸附，转染效率较中性载体提升2.8倍。
结构保护效应：SiNPs的介孔结构减少DNA酶降解（半衰期延长至24 h）。
安全性优势：PLA-SiNPs的LD50（500 μg/mL）高于PEI（200 μg/mL），适合长期应用。
参考文献
1. Li X, et al. Adv Mater. 2024; 36(12): 2304567.
2. Chen H, et al. Bioconjug Chem. 2023; 34(7): 1245-1256.
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