超越光学极限：膨胀显微成像在神经病理学的应用

神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等，目前仍缺乏有效的治疗手段。想要攻克这些难题，深入了解大脑在疾病状态下的结构和功能变化至关重要，而这离不开强大的成像技术支持。今天，就让我们一同走进大脑成像的前沿领域，探索组织透明化和膨胀显微成像技术的神奇之处。
 

研究背景
大脑成像：神经退行性疾病研究的关键钥匙
神经退行性疾病种类繁多，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等。大脑的结构和功能极其复杂，不同细胞群体之间的连接和活动模式决定了其功能。在神经退行性疾病中，特定细胞类型的结构变化往往是疾病发生发展的基础。要深入理解神经退行性疾病的发病机制，就需要对大脑进行全面、细致的成像分析，从细胞和分子层面揭示其病理变化。然而，标准光学显微镜受光衍射极限的限制，而电子显微镜虽然能实现高分辨率的超微结构分析，但缺乏多色荧光显微镜的分子特异性和通量，难以同时对多个目标进行成像。

突破成像障碍：组织透明化的诞生
该技术通过使组织的折射率均匀化，让样本变得透明，从而可以使用荧光显微镜从一端到另一端对样本进行成像。其中，光片荧光显微镜（LSFM）是一种非常有效的成像工具，它能产生薄激光片来照亮整个样本中的单个平面，实现对大型标本（如整个小鼠大脑甚至完整的人体器官）的高速、高分辨率成像。

技术创新与应用
超越衍射极限：膨胀显微成像的原理与优势
为了突破光学显微镜的衍射极限，实现对亚细胞结构的高分辨率成像，科研人员开发了多种光学超分辨率显微镜（SRM）方法，如受激发射损耗（STED）显微镜、光活化定位显微镜（PALM）、结构光照明显微镜（SIM）和随机光学重建显微镜（STORM）等。这些方法虽然能够分辨30-100nm，但存在设备昂贵、操作复杂、多色成像困难等问题，限制了其在大多数生物医学研究实验室的广泛应用。

膨胀显微成像（ExM）通过使用可膨胀的水凝胶在整个组织中交联，诱导样本各向同性膨胀，从而使样本中的结构在常规光学显微镜下也能实现超分辨率成像。目前的组织膨胀方法可以使组织实现高达约4.5倍、10倍甚至约20倍的各向同性膨胀，使用常规共聚焦显微镜就能实现高达约25nm分辨率的亚细胞结构成像。膨胀显微成像操作相对简单，并且与多色免疫染色和荧光原位杂交（FISH）兼容，能够为神经病理学研究提供丰富的分子和结构信息。

膨胀显微成像下的神经退行性疾病：新的发现与见解
膨胀显微成像在神经退行性疾病研究中发挥了重要作用，为我们揭示了许多以往难以观察到的微观变化。在研究亨廷顿病时，不同的光学SRM方法，如STORM和STED SRM，被用于研究亨廷顿蛋白聚集状态，包括在活细胞、固定细胞中和其他纤维状物质的形成；SIM SRM则用于研究突变的亨廷顿蛋白（mHTT）聚集体与转录因子的相互作用，这可能导致了基因表达的改变。

在阿尔茨海默病研究中，不同的光学SRM方法帮助研究人员在体外和细胞模型，STED SRM还用于对死后大脑切片中的免疫标记进行成像。此外，还利用拓增显微镜发现了一些与神经退行性疾病相关的新结构和分子机制。

成像实验与结果分析
透明化助力疾病研究：在神经病理学中的应用实例
组织透明化技术为神经病理学研究带来了新的契机，让科研人员能够在更大的空间尺度上评估神经病理特征。在阿尔茨海默病研究中，研究人员利用组织透明化方法取得了许多重要发现。例如，Huang及其同事使用荧光染料对斑块进行染色，结合使用荧光团标记的凝集素对血管进行标记，并对整个小鼠大脑进行透明化处理。Hama等人应用组织透明化方法，在小鼠和人类大脑的整个半脑以及1-2mm厚的切片中可视化斑块、小胶质细胞和大脑超微结构，通过对斑块、神经元和小胶质细胞的染色，发现能较好地保留大脑超微结构，有助于使用显微镜检测突触后密度。此外，基于水凝胶的方法也被用于可视化人类大脑样本中，以及在小鼠模型中观察黑质纹状体轴突的碎片化和人类大脑中的路易小体病理。

联合应用的潜在价值
在神经病理学研究中，组织透明化方法可以与细胞类型特异性标记、突触标记以及神经元-星形胶质细胞兴奋性指标或神经胶质反应性指标的分析相结合，识别出受病理影响的相关大脑回路，研究不同神经病理如何影响全脑特定细胞群体的活动，从而深入了解神经退行性疾病中不同回路和神经元-神经胶质亚型选择性-差异性易损性的细胞机制。同时，结合自动成像和数据分析，可以评估潜在的治疗策略。而膨胀显微镜则可以进一步深入研究细胞类型特异性的分子机制，mRN和蛋白质定位的改变、局部突触翻译、蛋白质-蛋白质相互作用和病理蛋白质聚集等。

深远意义与展望未来
随着技术的不断发展，组织透明化和膨胀显微成像技术在未来还有很大的提升空间。在组织化学和光学方面的进步，以及开源光片显微镜的发展，将提高这些技术的适用性，增加可成像的生物分子范围和分辨率。同时，计算技术的发展，包括优化的数据分析工具、标准化的流程、数据格式和数据共享平台，将有助于对大量的脑成像数据进行定量评估和系统生物学层面的解释，推动神经退行性疾病研究取得更多突破。虽然目前这些技术还面临一些挑战，但随着科学技术的不断进步，我们能够借助它们彻底揭开神经退行性疾病的神秘面纱，为无数患者带来新的希望。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Parra-Damas A, Saura CA. Tissue Clearing and Expansion Methods for Imaging Brain Pathology in Neurodegeneration: From Circuits to Synapses and Beyond. Front Neurosci. 2020 Oct 5;14:914.
DOI：10.3389/fnins.2020.00914.