光声成像在肝癌微血管疾病诊断的应用

肝细胞癌（HCC）作为最常见的原发性肝癌，在中国发病率位居第三，死亡率在近十年内更是飙升了50%。它不仅严重威胁患者的生命健康，也给医疗研究带来诸多难题。传统的影像学检测方法，如核磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和超声成像等，都存在一定的局限性，难以精确地对HCC的微血管结构和微环境功能进行成像。而近年来，光声成像技术崭露头角，为肝癌研究带来了新的希望。今天，就让我们一起深入了解这项神奇的技术，以及它在肝癌微血管研究中的重要作用。

研究背景
肝癌的严峻现状与传统检测难题
正常情况下，肝脏细胞有序生长和代谢，但当肝细胞癌发生时，肝细胞会不受控制地分裂，在肝脏内部形成肿瘤。目前临床常用的肝癌检测手段中，MRI虽然能识别肿瘤位置，评估多种肝功能参数，但分辨率较低，无法对微小血管成像，且使用外源造影剂存在安全隐患；CT可以对肿瘤微小病灶成像，却因使用电离辐射而增加了潜在的癌症风险；超声成像作为一种非入侵的成像技术，其准确性很大程度上依赖于操作者的经验。所以，迫切需要一种更先进的技术来突破这些困境。

在实际操作中，研究人员选择不同的激光激发肝脏血液的声波信号。这是因为血红蛋白分子与氧气结合形成的含氧血红蛋白与不含氧的脱氧血红蛋白在这两个波长下的摩尔消光系数不同。利用这一特性，通过量化含氧血红蛋白浓度和脱氧血红蛋白浓度，就可以计算出血氧饱和度，从而评估肿瘤新生血管的氧水平。血氧饱和度是表征肿瘤微环境的重要指标，因为氧气对于生命活动至关重要，缺氧环境会导致细胞代谢异常、免疫调节失衡，甚至心肺功能下降，通过监测血氧饱和度，有助于深入了解肿瘤的生长状态和微环境变化。

多项研究已证实光声成像在肝癌诊断方面取得了显著成果。Yin等人利用光声染料实现了HCC细胞特异性光声成像；Zhou等人借助表皮生长因子受体（EGFR）的靶向作用，成功提高了光声技术对HCC的特异性检测效率；Qi等人则利用光声成像进行实时测量，准确实现了腹腔内HCC的诊断和治疗。

基于光声显微成像的肝癌微血管研究实验
实验仪器与准备
研究使用的高分辨率光声显微镜（PAM）成像系统十分精密。由两台波长独立激光器提供光源，两束脉冲激光经过分束器耦合，再通过聚焦透镜、针孔、镀铝反射镜等一系列光学元件，最终被物镜聚焦在样品上激发超声信号。超声换能器负责采集反射回的光声信号，而后利用放大器和数据采集卡将信号传输到计算机上进行重建，整个过程中的数据采样率、扫描步距和激光触发均由计算机精准控制。在实验前，科研人员先对肝癌细胞进行培养。将细胞放在培养箱中，在37℃的环境下培养。当细胞达到对数生长期时进行消化，利用离心机收集细胞，最后用细胞悬液，并与基质胶混合备用。

小鼠肝细胞癌原位模型构建
实验选用雄性裸鼠，饲养在26℃无特定病原体的环境中。构建模型时，先对小鼠进行消毒处理并麻醉，接着用无菌手术器械在小鼠腹部切开约5mm的伤口，暴露肝叶。然后用接种针吸取20μL细胞与基质胶的混合物，注射到小鼠肝脏浅表，缝合伤口后注射抗生素观察3天。在注射7天后，使用小动物活体荧光成像系统对小鼠肝脏进行成像，以此确定肿瘤位置。

肿瘤定位与成像分析
在进行活体成像之前，将小鼠暴露在暗室中12h，再通过腹腔注射荧光素溶液。荧光素底物在小鼠体内发生代谢反应5min后，使用小动物活体荧光成像系统进行成像分析。通过观察荧光素在小鼠体内的分布情况，就能准确确定肿瘤位置。之后，将活体成像数据导入图像分析软件进行处理和分析。利用高分辨率光声显微镜对小鼠的HCC组织和正常组织进行结构和功能成像。采集到的原始数据会导入到软件中，通过反投影滤波重建和光谱分离算法，提取血管密度等参数进行数据分析。

实验结果：肝癌微血管的独特特征
小动物活体成像验证模型成功构建
利用小动物活体成像系统，通过调整对应的滤光片，选择生物发光模式进行成像。在成像过程中，调整荧光图像信号值范围，能够清晰地将荧光强度最大的区域定位为肿瘤的位置。这一实验结果有力地证明了HCC模型已成功构建，为后续研究奠定了基础。

而HCC模型鼠的肝表面PAM图像则呈现出截然不同的景象。肿瘤边界的肝小叶结构紊乱，血管扭曲；肿瘤旁边的血管网络比正常肝脏更复杂，肝静脉形态异常，直径变粗且排列不规则，出现多个分支和畸形小血管；肿瘤内部血管呈蛛网状向肿瘤中心生长。对肿瘤组织周围及肿瘤中心的微血管直径进行定量分析发现，正常小鼠右下肝叶位置的肝小叶血管直径为15-20μm，而HCC鼠的癌旁小叶间肝静脉分支直径约为25μm，癌旁肝静脉异常分支直径分别为38μm和30μm，肿瘤中心血管直径约为75μm，与正常血管相比，肿瘤血管直径显著增加。

肿瘤微血管密度与直径特征改变
对光声图像进行二值化处理后发现，与正常血管相比，癌变组织的血管密度整体减小。利用聚类算法对血管进行分类，并沿同一水平线提取信号值统计血管直径，结果显示癌旁血管出现异常增生，血管直径显著增加，主要集中在0-40μm，而正常肝脏组织的血管直径主要分布在0-20μm范围内。

肝癌微血管氧代谢功能异常
通过双波长图像的像素值计算肝脏血管的血氧饱和度，结果显示正常肝脏的血管结构清晰，氧气供应充足，中央静脉的血氧值比肝动脉略低。但在肿瘤组织中，微血管的异常结构导致了血流的不均匀分布。癌旁肝小叶明显低于正常肝小叶，肿瘤附近肝静脉血液供应不足造成周围组织缺氧，血管氧代谢能力降低。肿瘤中心的血管结构不完整，新生细微分支较多，需要更多的氧气供应，比周围组织更低。

应用总结与前景
在肿瘤微血管监测方面，它能够提供高分辨率的图像，更准确地检测微小血管和异常血管的形态，大大提高早期癌症检测的准确率。通过对图像进行分析，还可以评估微血管的密度、直径等指标，获得肿瘤组织的氧合水平和代谢活性等信息，从而判断肿瘤的生长状态并预测肿瘤的恶性程度。目前，一些抗血管生成药物已经应用于HCC的治疗，这些药物通过抑制肿瘤微血管的生长、破坏已有的血管、阻断血管通路等方式，减少肿瘤组织的营养供应和转移通路，达到抑制HCC生长和转移的目的。光声成像技术能够清晰地观察肿瘤微血管的变化，为评估这些抗血管生成药物的疗效提供了有力的工具。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
孙彤, 黄国家, 张振辉. 基于高分辨光声显微成像的肝癌微血管特征分析[J]. 中国激光, 2023, 50(15): 1507105.
DOI：10.3788/CJL230615