蛋白纯化系统如何去做亲和实验

亲和蛋白纯化是一种基于蛋白质与特定配体之间的特异性结合的纯化技术，广泛用于分离具有生物学功能的目标蛋白。以下是具体实验步骤：

以下所用的仪器为辉因科技的蛋白纯化系统Hass25，具体配置为：双泵梯度，最大流速25mL/min,多波长190-500nm的检测器。双板位收集器。图为以下：

Hass25 蛋白纯化系统

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1. 实验原理

亲和纯化利用目标蛋白和配体之间的高特异性相互作用，将目标蛋白从复杂的混合物（如细胞裂解液）中分离出来。常见配体包括抗体、金属离子、底物类似物等。

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2. 实验材料与设备
材料：

• 待纯化的蛋白质样品：如细胞裂解液、培养上清等。
• 亲和层析柱：选择与目标蛋白特异结合的填料。
  • 常见填料类型：
    • 抗体（如Protein A/G柱，用于抗体纯化）
    • Ni²⁺或Co²⁺（金属离子柱，用于His标签蛋白纯化）
    • GST（谷胱甘肽柱，用于GST标签蛋白纯化）
    • Lectin（用于糖蛋白纯化）
• 缓冲液：
  • 平衡缓冲液（Binding Buffer）
  • 洗脱缓冲液（Elution Buffer）
  • 洗涤缓冲液（Wash Buffer）

 

设备：

• 层析系统（如FPLC, 实验所用仪器为辉因科技的HassPure25）
• 离心机
• 超声波破碎仪（如需裂解细胞）
• UV检测器（检测蛋白的洗脱峰）

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3. 实验步骤
Step 1. 样品制备

1. 裂解细胞或组织，提取蛋白。

• 裂解缓冲液：含有适量的蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。
• 超声波、反复冻融或机械方法破碎细胞。

 

1. 离心去除细胞碎片，收集上清液（含目标蛋白）。

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Step 2. 层析柱的准备

1. 平衡亲和柱：

• 用平衡缓冲液（如含20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.4）多次冲洗亲和柱。
• 确保柱内环境适合目标蛋白结合。

 

1. 预洗柱子（可选）：

• 使用去离子水或低浓度洗涤液去除填料中的杂质。

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Step 3. 蛋白结合

1. 将样品缓慢加载到亲和柱上（流速低于0.5 mL/min）。
2. 保证目标蛋白与填料上的配体充分结合。

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Step 4. 洗涤杂质

1. 用洗涤缓冲液冲洗柱子，去除非特异性结合的蛋白。
2. 检测流出液中的蛋白含量（如280 nm吸光度），确保杂质被洗脱。

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Step 5. 蛋白洗脱

1. 使用洗脱缓冲液破坏目标蛋白与配体的结合：

• 常见洗脱方式：
  • 改变pH值（如加入低pH缓冲液）。
  • 添加竞争性配体（如谷胱甘肽）。
  • 使用高盐浓度或变性剂（如尿素、盐酸胍）。

1. 收集洗脱液中的目标蛋白（分段收集以确保分离纯度）。

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Step 6. 后续处理

1. 缓冲液更换：通过透析或超滤，将蛋白换入适合后续实验的缓冲液中。
2. 浓缩蛋白：使用超滤管浓缩蛋白。
3. 蛋白纯度检测：

• SDS-PAGE（蛋白电泳）
• Western Blot（验证特异性）
• 活性检测（如果蛋白有酶活性）。

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4. 注意事项

1. 样品保护：避免目标蛋白变性，保持低温（4°C）。
2. 避免污染：确保柱子、缓冲液和设备的清洁。
3. 填料选择：根据蛋白的标签或特性选择适合的亲和柱。
4. 蛋白保存：洗脱后的蛋白应迅速存储（如-80°C），避免降解。

如果有具体的实验条件或目标蛋白信息，可以进一步优化流程！对于实验来说，虽然影响因素众多，但是稳定性高，输出一致性好的仪器也是很重要的。

实验数据最后结果如下：