CytScop®mini智能细胞计数仪应用于毕赤酵母AOPI计数测试

毕赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）作为工业应用蛋白质生产最为常见酵母物种之一，已被成功应用于1000多种外源蛋白质的表达^[1]。目前发酵过程中测定菌体生长主要采用OD600、干湿称量法等无法精确的反应酵母的具体细胞数目，传统的平板菌落计数则需要36h的培养时间^[2-3]。本文采用CytScop^®mini设备针对毕赤酵母进行参数优化，提供快速、准确的毕赤酵母AOPI计数新方案。
测试样本及仪器设置参数

• 毕赤酵母：母液浓度约20×10⁶ cells/mL。
• 毕赤酵母仪器测试参数
• 细胞类型名称：AOPI-毕赤酵母
• 毕赤酵母样本仪器测试参数

稀释及取样
按照ISO6887-1:2017提供的倍比稀释指南，对样本母液进行连续稀释，得到6个稀释梯度：1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125，每个浓度梯度取3个平行，上机测试。
计数结果分析
变异系数（C.V）是衡量各观测值变异程度的一个统计量，常常用来反映一组数据的离散程度，在仪器的测量中可以用来反映仪器测量的精确性。C.V值越小，说明仪器测试数据离散程度越小，仪器的重复性越好，精确度越高。如下表1所示，毕赤酵母样品测试数据的C.V均值为3.47%。
表1 毕赤酵母实验原始数据及计算结果  
比例指数（PI）（引自ISO 20391-2）是用来量化细胞计数方法符合比例原则的程度，偏离比例性的情况说明测量存在系统性或非系统性误差，从而导致测量精度损失。PI值越小，说明仪器测试越接近比例原则，仪器精确度越高。如表1所示，本次细胞测试的PI为0.714。
对毕赤酵母结果进行线性拟合分析，结果如图2所示。   如图3所示，在不同浓度下毕赤酵母都有较好的荧光成像效果。  
如图4所示，毕赤酵母不同稀释梯度下能很好的被CytScop®mini识别标记，毕赤酵母具有高识别率。
对各稀释浓度活率进行统计计算，结果如图5所示。 结论
为验证CytScop^®mini对毕赤酵母AOPI染色下计数的精确度和准确度采用倍比稀释法进行测试。
在不同毕赤酵母稀释比例下均有较低荧光背景和清晰的细胞荧光，明场标记图像有良好的细胞识别率。
倍比稀释结果显示，6组不同稀释比例C.V均<10%，平均C.V=3.47%，线性回归R²=0.995，PI=0.714，体现了CytScop^®mini采用AOPI染色对毕赤酵母计数有良好的准确度和精密度。
综上，通过采用AOPI对毕赤酵母染色，在0.8-20M密度范围计数有良好的准确度和精密度。

参考文献
[1]茹扎·也里扎提,杨宇. 毕赤酵母中外源蛋白表达量的提升策略_茹扎·也里扎提[J]. 生物技术通报, 2024, 40(03): 118-134.
[2]方曙光,黄立,储炬,等. 流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性_方曙光[J]. 华东理工大学学报(自然科学版), 2006, (09): 1046-1049.
[3]张景宵. 毕赤酵母生长过程中的图像分析技术初步研究_张景宵[D]. 江南大学, 2023.