Western Blot高效制胶的实验操作流程及技巧分享

初次操作Western Blot，制胶是非常关键的一步。如何快速、高效地完成制胶，并确保实验成功？以下是几个新手必知的小技巧，让你轻松搞定WB制胶。

实验前的准备：
1. 玻璃板和梳子的清洁
用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，特别注意沟槽的清洁。清洗后用纯水冲洗，37度烘干或吹干。

2. 制胶试剂的准备
包括超纯水、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8 Tris-HCl、10% SDS、10% APS、TEMED，以及95%酒精。注意试剂的有效期和储存条件，如丙烯酰胺需避光4度保存，APS需-20度冷冻。

凝胶的制备：

1. 精准配比，避免误差
严格按照实验要求配制分离胶和浓缩胶，确保浓度准确，特别是丙烯酰胺的比例，一旦偏差会影响蛋白质的分离效果。

2. 确保溶液新鲜
TEMED和APS是制胶的关键成分，注意它们的保存期限，使用前最好现配，保证它们的新鲜度来确保胶的聚合效果。

3.操作快速，高效制胶
制胶时，特别是加入TEMED和APS后，需要迅速操作，因为这两者会加速凝胶的聚合反应，延迟可能导致胶体不均匀。分离胶灌胶后用酒精压平。

4.浓缩胶及插梳子
确认分离胶凝固后，倒掉酒精，吸干后迅速灌入浓缩胶并插入梳子。

5.除去气泡
浇胶过程中，小心气泡的产生，尤其在加入样品孔梳时。如果有气泡，可以用移液器轻轻吸走，保证胶体表面平整。

6.调控pH值，影响分辨率
不同分子量的蛋白质需要不同pH值的缓冲液，确保正确的pH值有助于提高蛋白质的分辨率。

7.凝胶的暂存
凝胶凝固后，取下玻璃板，用保鲜膜包裹，4度冰箱保存，不超过一周。

8.熟练掌握
Western Blot制胶虽然看似复杂，但熟能生巧，多练几次你就能找到最适合自己操作的节奏！

常见问题及解决方法：

1. 漏胶
通常是玻璃板未对齐或底部缺损导致。确保玻璃板干燥并对齐。

2. 胶不凝
多为APS失效。确保APS新鲜，并妥善保存。

3.胶凝固不均匀
可能是玻璃板未洗净或试剂混合不均。确保玻璃板和试剂清洁。

4.胶中有气泡
分离胶气泡可能是胶垫问题，浓缩胶气泡可能是梳子插入不当。使用实心胶垫或正确插入梳子。

5.浓缩胶边缘有缺损
可能是厚玻璃板边条密闭性不良。检查并更换必要的配件。

6.拔梳子后泳道有胶丝
减少TEMED的量，避免胶过早凝固。

7.泳道歪了
梳子与玻璃板不匹配。确保梳子与玻璃板规格相符。

8.电泳出现“漏样"
避免玻璃板与胶分离。小心操作，避免强行分离玻璃板。

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