Kilobaser微流控引物合成仪应用于菌落PCR检测大肠杆菌中的BAC

以大肠杆菌中细菌人工染色体（BAC）的检测为例，我们进行了菌落PCR，然后进行了琼脂糖凝胶电泳。本次实验的DNA引物是使用Kilobaser个人DNA和RNA合成仪制备的，并与从Eurofins订购的DNA引物进行了比较。
 

1 介绍
细菌人工染色体
质粒通常用于将 DNA 片段转染到细菌中。然而，质粒的使用在处理长度约为 15,000 bp 的大 DNA 片段时会达到极限。与质粒相比，BAC（如 pBelobac11）可以容纳大小高达 300,000 bp 的 DNA 片段。

例如，这种方法在人类基因组计划中用于对人类的整个 DNA 进行测序。为此，将人类 DNA 切成随机部分并整合到 BAC 中。由于 BAC 包含保守的 DNA 片段，因此在转染到细菌后很容易检测这些片段。从含有 BAC 的细菌菌落中提取 DNA 并进行桑格测序。

菌落 PCR
菌落 PCR 绕过了通常至关重要的从细菌中提取 DNA 或 RNA 的过程。这提供了一种更快且更不容易出错的替代方法来检测和扩增特定的 DNA 或 RNA 片段。在菌落 PCR 中，单个细菌菌落被稀释到无菌水中，并将其中的一份直接添加到 PCR 反应中。

KILOBASER DNA 合成
Kilobaser 个人 DNA & RNA 合成仪是一款台式微柱合成仪。其技术基于试剂盒系统与微流控芯片相结合。

标准 DNA 引物在 Kilobaser 合成后无需纯化。由于试剂消耗量低，盐残留量可忽略不计。引物合成后溶于水中，可立即使用。为了合成本应用中使用的 DNA 引物，使用了一个 Kilobaser 标准 DNA 试剂盒和 6 个 Kilobaser 标准芯片。

2 材料与方法
DNA 引物的制备
为了验证细菌中是否仍含有细菌人工染色体，利用Kilobaser个人DNA合成仪合成特异性引物，使用标准试剂盒和6个标准微流体芯片。

•   hV-UL30-FP, ATCAACTTCGACTGGCCCTT

•   hV-UL30-RP, CCGTACATGTCGATGTTCAC

•   gC-FP, TCACCATGGAGTTTACGGGC

•   gC-RP, GTACTCGGTCTGCTCGTACG

•   UL6-FP, GACCTCAGCAAGTCCATGGA

•   UL6-RP, GGCGCAGAATCTTGAAGCAG

合成后，将 DNA 引物悬浮于 30 µL 无核酸酶水中，涡旋 2 分钟。使用 QubitTM (ThermoFisher) 确定引物浓度 (300 pmol)。

菌落 PCR
接下来，我们对单个大肠杆菌菌落进行菌落 PCR。将其在 300 µL 高压灭菌去离子水中无菌稀释。将 1 µL 等分试样转移到 50 µL PCR 反应中。

50 µL 菌落 PCR 反应混合物

•   1 µL 正向引物 (Kilobaser / eurofins)

•   1 µL 反向引物 (Kilobaser / eurofins)

•   1 µL 稀释的单个大肠杆菌菌落

•  25 µL Dream Taq PCR 主混合物 (Thermo Fisher)

•   无核酸酶水至 50 µL

热循环概况

• 95°C 1.5 分钟

• 38 次 95°C 30 秒，53°C 30 秒，72°C 1 分钟

• 72°C 10 分钟

• 然后将 PCR 片段放在 1% 琼脂糖凝胶上，并根据大小分离

3 结果
我们预期的DNA片段长度如下：

•  UL30 – 179 bp

•   gC – 197 bp

•   UL6 – 142 bp

图 1 显示了透射仪上得到的琼脂糖凝胶。使用 100 bp 标准梯度，我们可以看到 UL30 刚好低于 200 bp 标记，正如预期的那样。与 UL6 引物匹配的 DNA 片段也显示出预期的大小。gC 片段比预期的要大得多，在这里我们可以假设引物设计不良或退火温度不匹配。尽管如此，至少有一个 DNA 片段表明一个结合引物。PCR 反应在所有比较中都显示出片段长度和强度没有差异。
 

图 1 用于检测大肠杆菌中人工细菌染色体的菌落 PCR 琼脂糖凝胶。从左到右的条带描述为：100 bp 梯状条带、带有 Eurofins(E) 引物的 UL30、带有 Kilobaser(K) 引物的 UL30、Lambda-Hind 梯状条带、带有 Eurofins 引物的 gC、带有 Kilobaser 引物的 gC、带有 Eurofins 引物的 UL6、带有 Kilobaser 引物的 UL6。

使用 Kilobaser 合成引物和从在线合成供应商 (Eurofins) 订购的引物进行的 PCR 产物的片段长度和强度没有差异。

4 结论
我们已经证明所选的细菌菌落含有 BAC。因此，可以提取并测序该菌落中的 DNA。
需要重新设计 gC DNA 片段的引物，因为至少一个引物未与目标序列结合。
此外，我们已经证明使用 Kilobaser 个人 DNA 和 RNA 合成器合成的 DNA 引物与从合成提供商在线订购的引物产生相同的结果。