透明三维成像技术的发展及其在病理检测中的应用

传统的病理诊断方法在肿瘤研究中一直占据着重要地位，但随着医学的发展，其局限性也日益凸显。传统的病理诊断主要基于对H&E染色组织的二维观察，它的观察区域相对狭窄，并且只能提供平面的二维图像，难以全面观察组织结构，特别是对于大病理标本，可能会遗漏一些病变。

为了克服传统方法的局限性，科研人员一直在寻求能够获取组织三维图像的有效方法。其中，连续切片成像技术是早期的尝试之一。早在20世纪60年代末和70年代，就有相关研究将大体图像与相应6-8μm厚度的组织切片进行匹配。如今，通过对连续切片组织进行计算机处理成像，可以生成重建的3D图像，从而能够观察到活检标本中诸如乳腺癌等病变的三维结构。然而，这种基于切片的方法由于组织切片不可避免的不连续性，无法实现对组织结构的完美连续观察。尽管它能够呈现病变的大致结构，如肿瘤体积、肿瘤结节分支以及肿瘤内部是否存在腔隙等，但要获得这样的重建3D图像，需要数百张来自连续切片组织的玻片，这无疑是一个成本高昂且劳动密集的过程。

组织透明化技术在近年来取得了显著进展。基于的方法三类，这些技术大致可分为疏水试剂、亲水试剂和水凝胶，它们各自具有不同的特点。其核心原理是通过化学或物理的方法使组织或器官透明，以便光线能够穿透深层组织，从而利用共聚焦荧光显微镜、多光子荧光显微镜和光片荧光显微镜等各种光学显微镜获取体积图像。在一些病理研究中，组织透明化和3D成像技术已经展现出了独特的优势。例如，在糖尿病小鼠的整个胰腺3D图像中，能够定量评估胰岛的体积和数量；在人类自闭症患者中，可以量化由神经突形成的异常梯形结构；在阿尔茨海默病的小鼠模型和人类患者的大脑中，还能够对β-淀粉样斑块的分布、结构、异质性以及与神经胶质细胞和血管的空间关系进行定量分析。

此外，其他研究小组也在正常和患者来源的组织中展示了3D观察的优势，并对其与石蜡包埋或H&E染色的兼容性进行了测试。尽管这些技术具有潜在的应用价值，但在实际应用中，它们大多仅应用于少量的病理样本，尚未有研究能够全面证明它们对临床病理检查的灵敏度和特异性有实质性的改善作用。

整体组织透明成像技术对组织的处理效果
1、组织透明化
整体组织透明成像作为一种亲水的组织透明化和3D成像技术，展现出了出色的性能。在对各种人体器官进行测试时，研究人员发现它对人肺和淋巴结组织的透明化效果尤为显著，其效率可与小鼠器官相媲美。具体来说，从甲醛固定的人体大脑、心脏、肺、肝、肾、脾、肠和淋巴结中切取2-5mm厚的组织块，按照既定的整体组织透明成像处理协议进行操作。结果显示，肺和淋巴结组织在经过整体组织透明成像处理后，变得高度透明，且在释放整体组织透明成像试剂后，通过PBS清洗，可以顺利地进行石蜡包埋、切片和H&E染色。对染色后的切片进行观察，发现整体组织透明成像处理对组织造成的损伤极小，如果有的话，也可以忽略不计。这表明整体组织透明成像技术应用于病理标本时，不会对后续的H&E染色产生不利影响，而H&E染色在医院的常规病理诊断中是必不可少的。

此外，整体组织透明成像处理还能够保留一些诊断标志物的抗原性，如在肺和淋巴结组织中的细胞角蛋白、α-SMA、CD68、CD79a和CD3等。这意味着病理学家在组织经过整体组织透明成像处理后，仍然可以进行免疫组织化学染色，以实现更准确的诊断。这一结果与之前对整体组织透明成像处理的小鼠乳腺腺组织的研究结果一致。对于其他器官，如脑、心、肝、肾、脾和肠等，虽然整体组织透明成像试剂对它们的透明化效果不如肺和淋巴结，但经过研究发现，经过脱蜡处理后的石蜡包埋组织可以用于整体组织透明成像处理。这为在更多类型的组织中应用整体组织透明成像技术提供了可能。

2、3D成像
整体组织透明成像技术不仅在组织透明化方面表现出色，在3D成像上也取得了重大突破。在对正常组织的研究中，以人肺组织为例，研究人员首先按照整体组织透明成像处理协议对组织块进行处理，然后使用抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体进行免疫染色，并使用细胞可渗透的绿色荧光核酸染料SYTO16对细胞核进行复染。通过共聚焦显微镜和光片荧光显微镜对处理和染色后的肺组织样本进行成像。结果显示，共聚焦显微镜获得的重建3D图像成功地可视化了包括支气管分支网络、血管系统和间质纤维在内的详细3D组织结构。通过免疫组织化学染色的抗α-SMA抗体，还能够选择性地标记穿过间质空间的血管网络。而且，当组织经过整体组织透明成像处理后，能够观察到至少400μm深的肺组织结构，而在未进行组织透明化处理时，最大只能检测到150μm深处的零散荧光信号。

同时，共聚焦显微镜的tile扫描工具还能够在相同分辨率下对更大面积的组织进行成像。除了肺组织，研究人员还对其他人体组织，如淋巴结和心脏冠状动脉进行了类似的处理、染色和成像操作。通过光片荧光显微镜获得的重建3D图像展示了各个组织的宏观解剖特征，如肺组织中的肺泡、支气管和血管网络，淋巴结中的淋巴滤泡以及心脏冠状动脉的外周分支。此外，通过鬼笔环肽进行的肌动蛋白染色，还能够帮助选择性地标记人脑皮层表面的小动脉，并在重建3D图像中清晰地显示出来。这些结果充分证明了整体组织透明成像技术在正常组织3D成像中的有效性和广泛适用性。

在对病理组织的研究中，整体组织透明成像技术同样展现出了强大的功能。例如，在对肺淀粉样变性患者的组织研究中，为了可视化血管壁上的淀粉样蛋白沉积，将患者在常规病理诊断后剩余的肺组织块进行整体组织透明成像处理和整体刚果红染色。刚果红染色在常规病理诊断中常用于淀粉样蛋白染色，与H&E染色配合使用。

研究发现，即使在经过整体组织透明成像处理后，刚果红染色仍然能够有效地发挥作用，组织块中的淀粉样蛋白沉积在标本中宏观可见。通过共聚焦显微镜或光片荧光显微镜对处理和染色后的样本进行3D成像，能够清晰地看到血管壁上的管状淀粉样蛋白沉积。使用硫黄素T染色也能够获得类似的图像。这表明整体组织透明成像技术能够实现对病理标本的3D成像，为病理诊断提供更直观、更详细的信息。

在肿瘤病理诊断中的应用
1、细胞异型性分析
对于肿瘤病理诊断来说，准确分析细胞的异型性是至关重要的。研究人员以石蜡包埋的恶性淋巴瘤组织为对象，展示了整体组织透明成像技术在这方面的应用价值。恶性淋巴瘤是一种起源于淋巴组织的肿瘤，在组织病理学上具有异常的形态特征，如组织结构紊乱（结构异型性）、细胞核形态改变（核异型性）以及恶性细胞的大小和形状的多变性（多形性）。由于淋巴瘤细胞的细胞质较少，因此核异型性和多形性在恶性淋巴瘤的诊断中尤为重要。为了测试这些特征是否能够通过3D成像进行观察和量化，研究人员从石蜡包埋的组织块中使用直径为4mm的活检打孔器取出组织，以尽量减少组织的损失。然后对取出的组织进行整体组织透明成像处理、成像和分析。

通过光片荧光显微镜获得重建3D图像和代表性的二维光学切片图像，发现恶性淋巴瘤细胞呈现出弥漫性浸润模式，这反映了其结构异型性。同时，在淋巴瘤标本中，通过鬼笔环肽染色的浸润性成纤维细胞的肌动蛋白纤维在局部可见，这有助于评估淋巴瘤细胞侵袭所导致的纤维化程度。在经过整体组织透明成像处理后的常规H&E染色切片图像与这些组织病理学特征一致。

此外，通过共聚焦显微镜获得的更高分辨率的图像能够更精确地显示细胞的核酸形态，与正常淋巴细胞相比，淋巴瘤细胞显示出核异型性和多形性，其细胞核形状和大小更加不均匀。通过对堆叠图像进行统计分析，进一步证实了淋巴瘤细胞在核形状上的异常，如核尺寸增加、核圆形度降低（核异型性）以及这些参数的更大方差（核多形性）。这些结果表明，整体组织透明成像技术可以应用于临床标本石蜡包埋档案中的3D病理检查，为肿瘤细胞异型性的分析提供了一种新的有效方法。

2、淋巴结转移筛查
肿瘤的淋巴结转移是影响患者预后的重要因素，因此准确检测淋巴结转移情况对于肿瘤的治疗和诊断至关重要。在本研究中，研究人员采用了基于整体组织透明成像的筛查方法对结直肠癌手术中的淋巴结进行检测，展示了整体组织透明成像技术在淋巴结转移筛查中的优势。在实验中，研究人员使用了来自结直肠癌手术患者的淋巴结样本，这些患者至少有一个淋巴结通过常规诊断方法被诊断为转移阳性（>pT1）。将甲醛固定的淋巴结切成两半，一半按照常规病理诊断方法进行石蜡包埋、切片和H&E染色，并在最大切面上进行组织学评估；另一半则进行整体组织透明成像筛查，即先进行整体组织透明成像处理，然后使用Alexa Fluor 647-共轭的抗细胞角蛋白抗体进行免疫染色，最后通过光片荧光显微镜进行成像，并对可疑信号进行基于切片的组织学评估，以获得最终诊断。

在对74个淋巴结的检测中，研究人员通过整体组织透明成像这种筛查方法，发现有4个淋巴结仅通过整体组织透明成像被新诊断为阳性转移。通过与常规病理诊断方法对比，计算出常规诊断方法的灵敏度为85.2%（23/27），有4个假阴性。而整体组织透明成像将灵敏度提高到了100%（考虑到筛查中的假阴性已通过深切片排除）。这表明整体组织透明成像能够提高检测转移癌结节的灵敏度，为肿瘤淋巴结转移的诊断提供了更准确的方法。

研究结果
整体组织透明成像技术可以成功地应用于临床病理诊断过程中。它不仅能够对石蜡包埋组织进行有效的处理和3D成像，而且在处理过程中不会损害组织的抗原性，不会影响后续的常规病理检查，如H&E染色。这使得整体组织透明成像技术能够与传统的病理方法兼容，为在临床实践中广泛应用提供了可能。

在肿瘤病理诊断中，整体组织透明成像技术展现出了独特的优势。通过对恶性淋巴瘤组织的研究，它能够对肿瘤细胞的异型性进行量化分析，为肿瘤的诊断提供了更客观、更准确的依据。同时，在淋巴结转移筛查方面，整体组织透明成像能够提高检测的灵敏度，有助于更早地发现肿瘤的转移情况，从而为患者的治疗提供更及时、更有效的指导。

整体组织透明成像技术的应用有助于回顾性和前瞻性临床病理诊断。在回顾性诊断方面，它能够对石蜡包埋的病理组织进行重新评估，挖掘出更多关于肿瘤细胞异型性等方面的信息。在前瞻性诊断中，它能够提高对淋巴结转移等关键病理特征的检测灵敏度，为肿瘤的早期诊断和治疗提供支持。总体而言，整体组织透明成像技术能够提高临床病理诊断的客观性、定量性和敏感性。它为病理学家提供了一种全新的工具，能够更全面、更深入地了解肿瘤组织的结构和特性，从而做出更准确的诊断。

展望未来
尽管整体组织透明成像技术取得了显著的成果，但仍然存在一些需要进一步改进和研究的方向。 在染色方法方面，虽然目前整体组织透明成像技术与多种抗体和染色剂兼容，但在染色效率和效果上还有提升空间。特别是对于3D组织中染色剂、抗体或探针的有效渗透，目前只有少数关键参数被确定。未来需要建立一种简单而强大的基于扩散渗透的染色方法，或者进一步识别基于小分子的染色试剂，如短肽和核酸（如适体），以提高染色效果和效率。

在组织透明化效率方面，虽然整体组织透明成像试剂对肺和淋巴结组织的透明化效果较好，但对于其他器官，如脑、心、肝、肾等，还需要进一步提高其透明化效率。这可能需要对整体组织透明成像试剂进行优化升级，或者寻找更有效的组织透明化和脱色化学试剂。

此外，对于一些含有内源性色素的组织，如含有黑色素的组织，目前还没有有效的处理方法，这也是未来需要解决的问题。 总之，整体组织透明成像技术为肿瘤病理成像带来了新的突破和希望。随着未来研究的不断深入和技术的不断完善，相信它将在肿瘤病理诊断领域发挥更加重要的作用，为人类健康事业做出更大的贡献。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Satoshi Nojima,Etsuo A. Susaki, Kyotaro Yoshida, Hiroyoshi Takemoto,Naoto Tsujimura, Shohei Iijima, Ko Takachi, Yujiro Nakahara, Shinichiro Tahara, Kenji Ohshima, Masako Kurashige, Yumiko Hori, Naoki Wada, Jun-ichiro Ikeda, Atsushi Kumanogoh, Eiichi Morii & Hiroki R. Ueda;CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis;2017 Aug 24;7(1):9269. doi: 10.1038/s41598-017-09117-0.