GeoMx DSP技术助力三级淋巴结构（TLS）研究
文章题目：部位、基质和细胞相互作用影响高级别浆液性卵巢癌中三级淋巴结构的活性
期刊：Cancer Cell IF：48.8
图形摘要
01 文章背景
高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是最具侵袭性且死亡率最高的上皮性卵巢癌。尽管HGSOC肿瘤中存在T细胞和B细胞的浸润，且这种免疫细胞的浸润与较好的预后相关，但现有的免疫治疗方法仍未能有效利用这些细胞。三级淋巴结构（TLS）是一种异位形成的功能性免疫枢纽，在许多实体瘤中与生存率的提高和免疫治疗反应的增强相关。但在HGSOC中，TLS的形成较为罕见，仅出现在约15%的患者中。因此，理解TLS在卵巢肿瘤中形成的驱动因素和低频原因，成为了亟待解决的生物学问题。
02 空间转录组技术
该文章使用了GeoMX DSP数字空间分析技术对来自104例高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者的肿瘤组织样本进行实验。这些样本代表了HGSOC的常见扩散部位，包括卵巢（OV）、输卵管（FT）和大网膜（OM）。形态学标志物为：CD20、CD45、PanCK和Syto13。为了对肿瘤微环境中不同的免疫结构的状态进行详细分析，研究还开发了一个TLS Activity多光谱免疫荧光panel，包含了CD4（标记T细胞）、CD20（标记B细胞）、CD21（标记滤泡树突状细胞网络）、AID（标记B细胞亲和成熟）、Ki67（标记细胞增殖）和PNAd（标记高内皮微静脉）等。
03 文章结论
1. B细胞和三级淋巴结构与HGSOC存活率的提高有关，但在不同肿瘤解剖部位存在差异
通过分析TCGA卵巢浆液性囊腺癌mRNA数据库，在分析了B细胞富集的预后效应后发现495名患者中约10%的患者具备B细胞富集的特征，且这些患者的总生存期显著延长。进一步分析了104例HGSOC样本中B细胞的亚群，发现这些细胞在卵巢、输卵管和网膜的不同解剖部位肿瘤组织中存在显著差异。卵巢肿瘤的淋巴样结构数量和大小显著少于输卵管和网膜。此外，输卵管和卵巢中的淋巴样结构在细胞组成上存在显著差异，卵巢中的B细胞比例显著低于输卵管，且免疫细胞浸润的血管结构（PNAd+）在卵巢中的数量也较少，这可能是B细胞减少的原因。
B细胞和三级淋巴结构与HGSOC患者的生存率相关
2. TLS特异性基因表达谱在HGSOC中的预后价值与部位特异性免疫活性
利用GeoMX DSP数字空间分析技术，在卵巢内的TLS区域中识别了特定的转录特征，筛选出330个显著标记卵巢肿瘤TLS的基因。在这些TLS与肿瘤和基质区域之间的基因集富集分析中，发现TLS区域表达与淋巴细胞、CD8 T细胞及免疫球蛋白相关，而非TLS区域则与整合素、干细胞特性和骨髓基质相关。研究进一步通过20个基因组成的“TLS-DSP”基因组评估了在TCGA数据集中患者的生存差异，发现TLS-DSP评分较高的患者表现出更好的生存率。此外，对比多光谱成像下FT、OV和OM肿瘤中的TLS结构发现，OM和FT肿瘤的TLS具有更高的免疫活性，而OV肿瘤中的TLS功能较低。进一步的基因分析表明，不同部位的TLS中存在特异性富集的免疫相关基因，OM和FT肿瘤中的TLS在免疫活性上显著高于OV中的TLS。
HGSOC中TLS特异性基因表达谱
3. HGSOC不同解剖部位中TLS状态的多光谱成像分析揭示了功能差异
在HGSOC的不同解剖部位中，含有生发中心（GC）的TLS在FT和OM中更为丰富，而在OV肿瘤中几乎没有。通过优化的TLS多光谱免疫荧光检测panel对TLS状态进行分级，将淋巴结构分为“淋巴聚集体”“不含GC的TLS”和“含GC的TLS”三种状态。FT和OM中的大部分淋巴聚集体符合“TLS”或“TLS+GC”的定义，并且GC频率显著高于OV中的TLS。FT和OM的TLS表现出更高的B细胞活性，其中AID+和Ki67+AID+ B细胞显著富集，显示出更强的克隆扩增和体细胞超突变。OM肿瘤中含有更多的MZB1+浆细胞，这一细胞在空间上也更接近TLS，进一步表明OM和FT的TLS在促进B细胞适应性免疫方面的作用更强，而OV中的TLS活性较低，缺乏有效的B细胞免疫支持结构。
多光谱成像揭示了跨HGSOC解剖部位的TLS状态的差异
4. 配对的HGSOC样本中不同部位TLS的差异及其转录特征揭示的免疫功能状态
通过比较来自同一患者的OV、OM和FT肿瘤样本，发现OM和FT中的TLS数量和生发中心（GC）比例显著高于OV，证实了不同解剖部位间的差异。此外，利用DSP技术分析了不同成熟度的TLS转录特征，定义了“未成熟”“中间状态”和“成熟”TLS。研究发现随着TLS成熟度的增加，B细胞和其他免疫细胞的活性相关基因上调，尤其是与T和B细胞激活、增殖及免疫检查点相关的通路。通过对成熟TLS中基质和免疫细胞的进一步分析，发现成熟TLS中的基质细胞表达了与细胞黏附、细胞骨架重组相关的基因（如PLEKHA2和TWF2），这表明基质细胞在维持TLS结构和支持免疫细胞迁移中发挥着重要作用。
空间转录组学揭示TLS状态和TLS驻留免疫细胞活性的转录谱
5. HGSOC中CA-MSCs在TLS附近减少及其对免疫功能的影响
研究发现在HGSOC中，癌症相关间充质干细胞（CA-MSCs）在靠近TLS的区域显著减少，而在远离TLS的区域增多。研究发现，CA-MSCs相比正常间充质干细胞（nMSCs），在B细胞活性和滤泡树突状细胞分化等支持免疫功能方面能力较弱。正常间充质干细胞在TLS附近促进免疫功能，而CA-MSCs则抑制了这些功能。CA-MSCs的高表达与较差的预后相关，提示间充质干细胞向CA-MSCs的转化会损害TLS的形成和免疫反应，导致HGSOC患者的临床预后较差。因此，靶向CA-MSCs可能有助于改善卵巢癌的免疫功能。
空间生物学显示在HGSOC患者中邻近TLS的CA-MSCs减少
04 文章总结
这项研究使用了DSP空间转录组学分析方法，结合免疫细胞的功能研究，探讨了不同肿瘤微环境中三级淋巴组织的形成与功能。研究发现，卵巢（OV）TME相比输卵管（FT）和卵巢膜（OM）TME，不利于TLS的形成。尽管卵巢TME中存在B细胞亚群，但TLS的形成较少，并且这些B细胞的功能较弱。FT和OM的TLS中有较高的生发中心形成，但由于CA-MSCs的存在，浆细胞的产出减少。CA-MSCs与TLS空间分布相互隔离，且能够抑制B细胞的粘附和功能，这可能对免疫反应产生不利影响。进一步的分析显示，CA-MSC的转录特征与免疫抑制相关，而正常MSC则支持TLS的形成和功能。此外，研究还揭示了TLS的转录特征在年轻患者中具有较强的预后价值，而CA-MSC的存在则会抑制这一预后效应。研究表明，靶向CA-MSCs可能是一种有效的策略，以改善TLS功能并增强免疫治疗反应。
