Western blot样品准备常见问题及解决方案

众所周知，WB实验是蛋白质研究的基础实验之一。WB的操作看似简单，做好确是不简单的。要想取得漂亮的WB条带，样品的制备是前提保证。样本制备是WB实验的第一步也是最重要的一步，可分为样本采集、样本裂解、蛋白定量和蛋白变性四个步骤。在此过程中，大家会遇到各种奇奇怪怪的问题，这里给大家汇总了一些样本制备过程中经常遇到的问题及解决方案，为大家答疑解惑。

问题一：出现透明胶状物  

可能原因：基因组复合物释放出来

解决方案：

1.适当超声或使用1ml注射器反复抽吸可以打断基因组DNA从而使粘稠感消失。

2.加入loading buffer煮沸变性的时候，可以稍微延长煮沸的时间，充分煮沸后一方面可以使结合在基因组DNA上的蛋白充分释放，同时可导致基因组DNA的部分断裂从而使粘稠感消失。

3.裂解的时候在裂解液中加入广谱核酸酶。

 问题二：蛋白浓度低  

可能原因：

1.细胞或者组织量偏少。

2.样本跟裂解液的比例不合适。

3.没有充分裂解，或者裂解过程中蛋白降解。

解决方案：

1.增加样本量。

2.根据样本的量调整裂解液量。

3.裂解时间要充足，组织样本要借助物理破碎，细胞样本要吹打或者颠倒混匀，裂解液里要加酶抑制剂。

 问题三：上清漂浮一层油脂  

可能原因：样本富含脂肪

解决方案：

1.裂解后样本低温静置，吸出漂浮的油脂。

2.当吸取依然达不到要求的时候,可以尝试用二氧化硅吸附。

 问题四：贴壁细胞收集是刮下来还是胰酶消化  

解决方案：

两种方式都是可行的，各有利弊。不必担心刮刀收集会刮坏细胞，如果胰酶消化的程度掌握不好，也会让细胞破损。胰酶消化可能会对某些膜蛋白产生影响，刮刀收集效率会略低，可根据自己的实验来选择细胞收集的方式。做总蛋白提取时，可选择直接在器皿中进行裂解，无需提前收集。

 问题五：WB蛋白样品堵孔  

可能原因：

1.脂类对浓缩胶点样孔的堵塞。

2.样品粘度高而引起的堵孔。

3.裂解不充分而引起的堵孔。

4.还原剂的失效而形成的蛋白复合物。

解决方案：

1.脂类对浓缩胶点样孔的堵塞，可以将样品静置在冰上或4℃冰箱，让脂类析出，从而去除脂类。

2.样品粘度高而引起的堵孔，可以将样品重新进行超声破碎，彻底地将样品中的核酸打断成小片段，从而降低样品的粘度。

3.裂解不充分而引起的堵孔，在样品变性之前，加入足量的裂解液，将样品浓度降下来，才能够打开蛋白质聚集形成复合体。

4.还原剂的失效而形成的蛋白复合物，可以保存一段时间后的样品再次使用前只需补加适量的还原剂重新煮样就可以打开此类复合物了。

 问题六：细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮  

可能原因：

1.蛋白变性不彻底。

2.样本浓度过高。

解决方案：

1.适当提高SDS浓度，同时延长煮样时间。

2.用水或PBS稀释样本。

 

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