膜片钳助力通过patch-seq技术记录小鼠GABA神经元的转录和电生理特性

概述
本文通过多模态整合分析，对大脑皮层中的GABA能中间神经元进行了详细的分类和描述。通过对517个GABA能神经元的形态重建，研究发现大部分转录组类型（t-types）在视觉皮层中占据特定的分层位置，且这些细胞在映射到特定t-type时表现出一致的电生理和形态特性。这些特性在不同t-types之间既有离散变化又有连续变化。最终定义了28种met-types，这些met-types具有一致的形态、电生理和转录组特性。

方法与结果
多模态数据收集与分析
本文通过Patch-seq技术收集了超过4,200个小鼠视觉皮层GABA能中间神经元的数据，包括超过500个神经元的形态重建。利用SMAR-Seq v4进行RNA测序，并通过Patch-seq记录单个神经元的转录组和电生理特性。

形态与电生理特征
研究发现，不同t-types在视觉皮层中的位置各异。例如，Sst met-types中的Sst Calb2 Pdlim5型在L2/3层中有显著的轴突投射，而Sst Tac1 Htr1d型则主要分布在L2/3层。此外，Pvalb met-types中的Pvalb Tpbg型和Pvalb Reln Itm2a型分别在L2/3层和L5层有广泛的分布。这些发现揭示了不同met-types在皮层中的精细定位及其对应的电生理特性。

met-types的定义与分类
通过整合形态学、电生理学和转录组学数据，本文定义了28种met-types。这些met-types不仅在转录组上一致，而且在电生理和形态特征上也高度相似。例如，Sst met-types包括Sst Chodl t-type、Sst Mme Fam114a1 t-type等，这些类型的细胞在L2/3层或L5层中具有特定的轴突内分布模式和电生理特性。Pvalb met-types如Pvalb Tpbg型和Pvalb Reln Itm2a型也在相应的皮层区域中表现出独特的特征。

以下为实验研究内容图表：

图1：从Patch-seq记录中获得的scRNAseq数据的转录组学分析。

(A)  补丁序列数据收集和处理管道的摘要。

(B)   基于基因表达主成分的转录组UMAP图（方法；左：n=6080个分离细胞，黑色，n=3855个来自Patch-seq记录的细胞，灰色）。中间和右边的图中的颜色表示t型。

(C)   标记基因在每个t型内的表达分布由成对的小提琴图表示，它们对应于Patch-seq记录和分离的细胞（Tasic et al.，2018）（每种类型的每列分别为右和左）。行是基因，黑点是中位数。每一行中的值在0和检测到的最大值之间标准化（y轴上显示），在log10的比例上显示。在两个数据集中，每个t型细胞的(D)层分布。在每一列中，分离的细胞和Patch-seq记录分别显示在左边和右边。每种类型的Patch-seq记录和分离细胞的细胞总数分别显示在每一列的左右下方。对于(C)和(D)，只有来自转基因株系的细胞这两个数据集的共性，只使用了至少5个细胞的类型（n=4651个分离细胞和n=2260个Patch-seq记录）。

(D)  只显示了具有特定层分配的细胞（n=3767个分离细胞和n=2260个Patch-seq记录）。

图2：不同t型细胞在公共参考空间中的单元格的位置。

(A)  所记录的细胞（n=2,930个细胞）位置的冠状视图，按转录组亚类组织，并按t型着色。视觉区域用一个较浅的背景来表示。为了清晰地显示，每种t类型都在单个皮质半球上可视化。插图显示了虚拟冠状面切片的自上而下的位置。插入的比例尺：2 mm。

(B)   与t型（n=2930个细胞）的距离，其位置与平均皮质层厚度对齐。

(A)和(B)中只显示至少5个高度一致映射细胞的t类型。

图3：转录组学类型的电生理学特征。

(A)  不同t型对1秒长电流步骤的反应实例，刺激振幅为−70pA和流变基（下痕迹）和流变基+80pA（上痕迹）。每个t型都有两个随机选择的例子。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms.

(B)    UMAP图，基于z评分的电生理稀疏主成分（sPCs）的投影。显示了所有细胞的四个示例sPCs的值（n=4,270）。

(C)   电生理学UMAP图显示了2955个细胞。

(D)  电生理学UMAP图，突出显示个体t型。箭头表示(A).中所示的示例的位置（填充：左，空心：右）。

图4：转录组学类型的形态学特征。

(A)  t型的代表性形态重建（由NBLAST相似性评分选择，方法选择）。右侧显示了从所有t型重建中计算出的树突和轴突深度直方图，以及躯体深度位置（黑点）。树突的颜色较深，轴突的颜色较浅。直方图显示为平均（线）±扫描EM（阴影区域）。

(B)  单个细胞轴突深度直方图与其t型平均直方图之间的相关性。在(B).中，只显示了至少有5个高度一致的映射细胞的t型。

图5：满足类型的定义和类型预测精度。(A)t型与无监督联合电生理和形态学聚类结果的比较（(A)型）。同时显示了高度一致和中等一致的细胞（n=503）。me型/t型组合之间的交叉映射的(B)图可视化。节点表示在(A)中具有特定me型/t型组合的细胞，节点的大小表示细胞的数量。边缘表示在一个给定的me型/t型组合中存在的细胞，它们有一定的概率映射到另一个t型（橙色线）或me型（蓝色线）；较粗的线表示更高的概率。没有显示只有一个单元格和没有连接的节点。概述的组表明连接良好的me型/t型组合，形成28个met类型（方法）。(C) River图显示了t型（底部）和相遇型（顶部）之间的关系。(D)随机森林分类器的袋外混淆矩阵，训练后从电生理特征预测t子类（左）和t类型（右）。只有t型与至少使用了10个高度一致的映射单元格。（E-F）与(D)相同，但仅从形态学特征(E)以及形态学和电生理特征来预测t类型(F)。只使用至少有5个高度一致的映射细胞的t型。(G)与(D)相同，但可从形态学和电生理特征来预测met类型。只使用至少有5个单元格的满足类型。对于（D-G），这些值被归一化为行和。
 

图6：已鉴定的Sst和Pvalb抑制相遇类型的总结。(A)每个Sst相遇类型的形态和电生理反应的例子。在形态学图中，体细胞分布在左侧的条形图表示（较厚： 25%至75%范围，较薄： 5%至95%范围）。平均轴突深度直方图显示在右边（归一化到其最大值）。比例尺： 200µm。电生理学的例子包括超极化电流步骤（−70或−90pA，下）诱发的反应，流变基的反应（下），以及流变基+ 40 pA刺激诱发的反应（上）。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms。流变基轨迹的平均第一个峰值的相位图显示在示例轨迹的下面；子类范围的平均值是灰色虚线。基于基因表达（上图1B）和电生理特征（下图3B-c）的(B)UMAPs，Sstmet类型以颜色显示。在顶部，Patch-seq细胞显示为浅灰色，分离的细胞显示为深灰色。(C)在Sst相遇类型间差异表达的标记基因的点图。

表达值（阴影）经过对数转换并归一化到最大值；点的大小表示在t型内表达该基因的细胞的比例。(D)通过Sst相遇型选择形态学和电生理特征。平均值显示为灰色菱形。测量了流变基+ 40 pA振幅响应的CVISI（峰间间隔的变化系数）。（E-H）与（A-D）相同，但对于Pvalbmet类型。在(D)中，在流变基处测量了第一个AP的潜伏期。另请参见图S6和S7以及表S2和S3。

图7：已鉴定出的Lamp5、Sncg和Vip抑制相遇类型的总结。(A)每个Lamp5相遇型的形态和电生理反应的例子。在形态学图中，体细胞分布在左侧的条形图表示（较厚： 25%至75%范围，较薄： 5%至95%范围）。平均轴突深度直方图显示在右边（归一化到其最大值）。比例尺： 200µm。电生理学的例子包括超极化电流步骤（−70或−90pA，下）诱发的反应，流变基的反应（下），以及流变基+ 40 pA刺激诱发的反应（上）。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms。流变基轨迹的平均第一个峰值的相位图显示在示例轨迹的下面；子类范围的平均值是灰色虚线。(B) UMAPs基于基因表达（上图1B）和电生理特征（下图3B-C），Lamp5met类型以颜色显示。在顶部，Patch-seq细胞显示为浅灰色，分离的细胞显示为深灰色。(C)在Lamp5集合中差异表达的标记基因的点图类型表达值（阴影）经过对数转换并归一化到最大值；点的大小表示在t型内表达该基因的细胞的比例。(D)Lamp5-MET-1相遇型细胞流变基扫描中Npy表达、轴突宽度：高度比和首次AP的潜伏期。数值与第三个转录组主成分（PC-3）相对应，从4020个差异表达基因的第三个转录组主成分（PC-3）中计算出来。灰色线为滚动平均值（10个单元格的窗口）。（E-G）与（A-C）相同，但对于Sncg满足类型。(H)Sncg元型之间的电生理特征差异。平均值显示为灰色菱形。测量了流变基+ 40 pA振幅响应的CVISI（峰间间隔的变化系数）。（I-K）与（A-C）相同，但对于Vipmet类型。(L)与(H)相同，但对于Vip满足类型。测量了流变基+ 40 pA振幅响应的时间发射分数。

结论
本文的研究结果为理解大脑皮层GABA能中间神经元的类型提供了系统的框架。通过整合多种数据分析方法，本文不仅揭示了不同met-types的精细分类，还展示了这些类型在皮层中的精确定位及其电生理特性。这一研究为未来进一步探索神经元类型及其功能提供了重要的基础。

文献参考：Gouwens, Nathan W et al. “Integrated Morphoelectric and Transcriptomic Classification of Cortical GABAergic Cells.” Cell vol. 183,4 (2020): 935-953.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.09.057

番外
这项研究中提出的新的分类方法对理解大脑功能和疾病的意义何在？
研究中的分类方法对理解大脑功能和疾病的意义，主要体现在以下几个方面：
1. 提供更精确的神经元类型定义：通过整合形态、电生理和转录组数据，本文定义了28种met-types，这些met-types不仅在转录组上一致，而且在电生理和形态特征上也高度相似。这种综合分类方法提供了一种更为精确和系统的方式来识别和定义不同的神经元类型。
2. 揭示不同神经元类型的精细定位和特性：研究发现，不同met-types在视觉皮层中的位置各异，且具有特定的轴突内分布模式和电生理特性。例如，Sst met-types中的Sst Calb2 Pdlim5型在L2/3层中有显著的轴突投射，而Sst Tac1 Htr1d型则主要分布在L2/3层。这些发现揭示了不同met-types在皮层中的精细定位及其对应的电生理特性。
3. 为研究大脑功能和疾病提供新的视角：通过对GABA能中间神经元的详细分类和描述，本文为进一步研究这些细胞的功能和相互作用提供了基础。这有助于理解大脑在不同状态下（如健康和疾病）的工作机制，并可能揭示与特定疾病相关的关键神经元类型。

综上所述，这项研究中提出的新的分类方法不仅提高了我们对大脑神经元类型的认知精度，还为进一步研究大脑功能和疾病提供了重要的理论基础和应用前景。