应用案例：对牙膏中的耐热大肠菌群进行检验

方案摘要：耐热大肠菌群系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5℃培养24 h～48 h能发酵乳糖产酸并产气。该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价牙膏的卫生质量, 推断牙膏中有否污染肠道致病菌的可能。本方法利用fluidot移液类产品达到快速检测出牙膏中耐热大肠菌群含量。
 
方案详情：

• 实验原理

使用特定的培养基和试剂用于支持耐热大肠菌群的生长‌，通过培养基的培养和适当的温度条件下（通常是35-37℃）的孵育，观察是否有耐热大肠菌群生长‌。
二、实验准备
1、 仪器
①  恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44.5℃±0.5℃。
②  温度计。
③  显微镜。
④  载玻片。
⑤  接种环fluidot  FDT-D80001
⑥ 电磁炉。
⑦  三角瓶：250 mL。
⑧  试管：18 mm×150 mm。
⑨  小倒管。
⑩  pH计或pH试纸。
⑪  高压灭菌器。
⑫ 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）FDT-SP01001
⑬无菌吸管：10 mL（具0.1 mL刻度）FDT-SP01010
⑭手动移液器：fluidot  1 mL  MSP1K与 10 mL  MSP10K
⑮电动移液器：pipetty  1 mL  MSIC01-02-1000
⑯吸头：1.5mL   FDT-1500-1-TSF
⑰灭菌平皿：fluidot  FDT-9CM-2-S，直径90 mm。
⑱蠕动泵分液器：fluidot  600D
 
2、培养基和试剂
①  SCDLP液体培养基
②  双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基   
③  伊红美蓝（EMB）琼脂   
④  蛋白胨水（靛基质试验用）
⑤  靛基质试剂
⑥  革兰氏染色液：  
三、实验步骤
 
①  取10 mL 1:10的检液，加到10 mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44.5℃±0.5℃培养箱中培养24 h±2 h，如既不产酸也不产气，继续培养至48 h±2 h，如仍既不产酸也不产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。
②  如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18 h~24 h。同时取该培养液1~2滴接种到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培养24 h±2 h。 经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽；或粉紫色、中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。
③  挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。
④  在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5 mL，观察靛基质反应。阳性反应液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。
⑤  如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统，可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落，用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
四、检验结果报告
经上述检验步骤，若发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性无芽胞短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。